中国期刊网-投稿、查重、发表有保障。
您的位置: 主页 > 学术论文 > 农业论文 >

转基因玉米ND207转化事件特异性定性PCR检测方法及其标准化

发布时间:2023-01-03 09:57:28

摘    要:转基因玉米ND207是中国农业大学研发的转mCry1Ab和mCry2Ab基因的抗虫玉米,本研究的目的是建立ND207转化事件特异性定性PCR检测方法。根据研发者提供的引物进行PCR扩增,PCR产物测序分析,获得了5'端旁侧序列262 bp,包括109 bp的载体序列和153 bp的玉米基因组序列,3'端旁侧序列316 bp,包括76 bp的载体序列和240 bp的玉米基因组序列。针对两端旁侧序列设计14条引物,组成25对引物组合进行引物筛选,选中3'端一对最佳引物优化PCR反应体系及反应条件,建立ND207的转化事件特异性定性PCR检测方法,PCR产物片段大小为166 bp。经过测试,该方法的检出限为0.1%,相当于20个拷贝的ND207特异分子片段。国内8家转基因生物安全检测机构对本方法进行了特异性测试、检出限测试和再现性测试,循环验证报告显示:该方法符合国家标准方法的各项要求,可在检测行业推广应用。ND207转化事件特异性定性PCR检测方法的建立,为我国ND207及其衍生品系的安全监管提供技术支撑。


关键词:转基因玉米; ND207;旁侧序列;转化事件特异性;定性PCR;


Event-specific PCR detection method of transgenic maize ND207 and its

standardization

CHANG Li-Juan

LIANG Jin-Gang

SONG Jun

LIU Wen-Juan FU Cheng-Ping DAI

Xiao-Hang WANG Dong WEI Chao XIONG Mei

Institute of Quality Standard and Testing Technology Research, Sichuan Academy of

Agricultural Sciences Development Center of Science and Technology MARA Institute of

Remote Sensing and Digital Agriculture, Sichuan Academy of Agricultural Sciences


Abstract:Transgenic maize ND207 is an insect-resistant maize with mCry1Ab and mCry2Ab genes developed by China Agricultural University. The objective of this study is to develop the event-specific PCR detection method for ND207. The PCR amplification was performed according to the primers provided by the ND207 developer. The sequence of insertion site of ND207 was sequenced and obtained 262 bp of the 5'-flanking sequence, including 109 bp vector sequence and 153 bp maize genome sequence, 316 bp of the 3'-flanking sequence, including 76 bp vector sequence and 240 bp maize genome sequence. 14 primers were designed at both ends to form 25 primer pairs. The best primer pair at the 3' end was selected to optimize the PCR reaction system and reaction condition. The event-specific qualitative PCR detection method of ND207 was established and the PCR product size was 166 bp. After testing, the results showed that the detection limit of this method was 0.1%, equivalent to 20 copies of ND207 specific molecule fragment. 8 GMO safety testing institutions in China tested specificity, detection limit, reproducibility of the method, and the circular verification report revealed that the method met the requirement of the national standard method, which could be promoted and applied in the testing industry. The established event-specific qualitative PCR detection method of ND207 provides the technical support for the safety supervision of ND207 and its derivatives in China.


Keyword:transgenic maize; ND207; flanking sequence; event-specific; qualitative PCR;


据国际农业生物技术应用服务组织报道,2019年全球29个国家总共种植了1.904亿公顷的转基因作物,影响全球约19.5亿人口的粮食供应,对全球粮食安全、可持续性发展、减缓气候变化做出了重大贡献。全球前五的转基因作物种植国家分别是美国、巴西、阿根廷、加拿大和印度,主要种植的转基因作物为棉花、玉米、大豆和油菜。玉米作为第二大转基因种植作物,自1995年在美国获得商业化许可后推广应用十分迅速。同时,玉米是我国最重要的食物及工业原料,国内的转基因玉米研发工作取得了较大的进步,如抗虫耐除草剂玉米DBN9501、抗虫耐除草剂玉米DBN9936、抗虫耐除草剂玉米DBN3601T、耐除草剂玉米DBN9858、抗虫耐除草剂玉米瑞丰125、抗虫玉米浙大瑞丰8、抗虫玉米ND207先后均获得了农业转基因生物安全证书。


转基因玉米ND207是中国农业大学研发的转基因抗虫玉米新品种,该品种通过农杆菌侵染的方法把抗鳞翅目害虫基因mCry1Ab和mCry2Ab转入到具有高效转化效率的玉米自交系杂交组合HiII中,用筛选标记基因bar进行筛选,然后通过回交导入到郑58的自交系获得ND207,修饰后的mCry1Ab和mCry2Ab抗虫基因共同作用能够有效抑制抗性种群产生。目前,ND207已经获得了农业转基因生物安全证书,具有重要产业化应用前景,建立ND207的检测方法是商业化推广的重要环节。


转基因成分检测方法应用最广的是PCR检测法,普通PCR由于操作简便、效率高、成本低等优点而广泛应用于各检测机构。根据引物设计位点的不同,转基因成分PCR检测方法可分为筛查法[1]、基因特异性方法[2]、构建特异性方法[3]和转化事件特异性方法[4]。转化事件特异性PCR检测方法的建立必须克隆到插入位点的旁侧序列,PCR引物一端设计在受体植物基因组上,另一端设计在外源载体序列上。由于插入位点具有唯一性,转化事件特异性PCR检测可以确定转基因植物的身份。近年来为了满足我国转基因市场监管的需要,研究人员研制了包括转基因水稻TT51-1[5],转基因玉米98140[6]、MON88017[7]等一系列转化体的转化事件特异性PCR检测方法,形成了转化事件特异性PCR检测方法的国家标准体系[8,9,10,11]。由于ND207是新研发的转基因玉米转化体,目前尚无ND207检测方法的相关报道。本研究从分析ND207旁侧序列入手,通过引物筛选,找到最佳的引物设计位点,再优化PCR反应体系和反应条件,建立ND207转化事件特异性定性PCR检测方法。通过8家转基因生物安全检测机构的循环验证,ND207转化事件特异性定性PCR检测方法满足国家标准的各项要求,可形成国家标准在检测行业推广应用。ND207转化事件特异性定性PCR检测方法的建立,将对该转化体的安全评价、监管和知识产权保护提供重要的技术支撑,促进我国玉米产业的健康发展。


1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料ND207纯合体玉米品种、ND207受体玉米品种、相应非转基因作物填充的各转化体含量为1%的转基因作物混合粉末。其中包括13种转基因大豆混样:GTS40-3-2、MON89788、A5547-127、A2704-12、356043、305423、CV127、MON87701、MON87708、MON87769、MON87705、FG72和DAS81419-2。18种转基因玉米混样:Bt11、Bt176、MON810、MON863、GA21、NK603、T25、TC1507、MON89034、MON88017、59122、MIR604、3272、MON87460、DAS40278-9、4114、MON87427和5307。8种转基因水稻混样:TT51-1、KF-6、KMD-1、M12、KF-8、KF-2、G6H1和T1C-19。7种转基因棉花混样:MON1445、MON531、MON15985、LLCOTTON25、MON88913、GHB614和COT102。10种转基因油菜混样:MS1、MS8、RF1、RF2、RF3、T45、Oxy235、Topas19/2、MON88302和73496。以上试验材料由农业农村部科技发展中心提供。试验材料阴性对照(非转基因玉米、水稻、大豆、油菜和棉花组成的混合粉末)由本实验室保存。试验材料ND207不同质量分数的样品由ND207纯合体玉米品种及ND207受体玉米品种粉末按不同质量比例(W/W)混合制备而成。


1.2 试验方法

1.2.1 玉米基因组DNA的提取和纯化

按照植物基因组DNA纯化试剂盒(TIANGEN®,天根生化科技(北京)有限公司)说明书分离、纯化植物材料基因组DNA,用超微量分光光度计(Nanodrop®1000,赛默飞世尔科技(中国)有限公司)测定基因组DNA浓度和纯度。所有植物材料基因组DNA浓度稀释至25 ng µL-1。


1.2.2 ND207旁侧序列的获取

根据研发单位提供的资料,ND207整合入玉米基因组的T-DNA全长序列为8060 bp,全长序列包含3个外源基因及其调控元件(图1),研发单位提供了分别针对5'端和3'端的2组PCR检测引物(表1)。采用研发者提供的引物分别对ND207纯合体玉米品种、ND207受体玉米品种基因组DNA进行PCR扩增,扩增产物测序分析,获取了ND207旁侧序列。


1.2.3 引物设计

根据ND207 5'端和3'端旁侧序列,采用Primer5设计多条PCR引物见表2,将正向和反向引物组合进行PCR扩增,扩增产物片段大小见表3。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,用1×TE缓冲液稀释至 10 µmol L -1的工作液。


表2 PCR反应引物序列信息表


1.2.4 PCR扩增

(1)引物筛选:为了获取最佳引物组合,对表3的引物组合进行引物初筛,用ND207质量分数为1%的DNA模板进行PCR扩增,选取电泳条带明亮无拖尾的引物进行特异性检测。特异性筛选设置阳性对照(质量分数为1%的ND207)、阴性对照(非转基因混合粉)、转基因玉米混样、转基因水稻混样、转基因油菜混样、转基因大豆混样、转基因棉花混样,PCR扩增筛选出特异性好的引物进行灵敏度检测。引物灵敏度筛选样品设置ND207质量分数为10%、5%、1%、0.5%、0.1%5个样品及空白对照,PCR扩增筛选出灵敏度好的引物。引物筛选PCR反应设置2个平行,根据实验结果,确定最佳引物组合。(2) PCR反应体系和条件的优化:采用最佳引物组合,以ND207质量分数为1%的DNA为模板,设置3个平行,对PCR反应的关键因子引物浓度及退火温度进行优化,设置0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 μmol L-1 6个引物浓度梯度,退火温度52℃、54℃、56℃、58℃和60℃ 5个温度梯度正交组合进行PCR扩增。PCR产物电泳分析确定最佳的反应体系和反应条件,建立ND207转化事件特异性定性PCR检测方法。(3)方法测试:为测试方法的灵敏度,设置ND207质量分数为10%、5%、2%、1%、0.5%、0.1%和0.05% 7个样品及空白对照进行PCR扩增,每个样品3个平行,PCR产物电泳分析灵敏度测试结果。随机抽取60份ND207质量分数为0.1%的样品,提取基因组DNA进行PCR扩增,并对结果进行分析。不同实验室不同操作人员采用不同仪器(ABI Verit,赛默飞世尔科技(中国)有限公司;Eppendorf Nexus Gradient,艾本德(上海)国际贸易有限公司)对阳性对照(质量分数为1%的ND207)、阴性对照(非转基因混合粉)、检出限样品(质量分数为0.1%的ND207)进行PCR扩增,每个样品10个平行,对方法再现性进行测试。(4)方法的循环验证:为验证抗虫玉米ND207转化事件特异性定性PCR检测方法的特异性、检出限、再现性等参数,综合评价方法的科学性、先进性和适用性,按照《转基因植物及其产品成分检测 转化体特异性和基因特异性定性PCR方法标准文本验证方案》(农基安标[2012] 1号)及《转基因植物及其产品成分检测定性PCR方法制定指南》[13]的要求,设计标准文本的复核验证方案,并准备试验材料,邀请8家转基因生物安全检测机构对方法进行循环验证。


1.2.5 PCR产物琼脂糖电泳

称取3 g琼脂糖(Multi-purpose Agarose,上海起发实验试剂有限公司),加入150 mL TAE缓冲液及15 µL核酸染料(GS-GelRed,北京金沙生物科技有限公司),配制2%琼脂糖凝胶,PCR产物及marker (E-Gel低范围定量DNA分子量标准,赛默飞世尔科技(中国)有限公司)上样5 µL,在90 V电压下电泳70 min,取出凝胶,放入凝胶成像系统(GelDoc Go,伯乐生命医学产品(上海)有限公司)进行图像采集。


2 结果与分析

2.1 ND207旁侧序列的获取

获取转基因植物外源T-DNA插入位点旁侧序列是建立转化事件特异性定性PCR检测方法的关键技术点,分别提取ND207纯合体及受体玉米基因组DNA,采用研发单位提供的引物ND207 5F、ND207 5R和ND207 3F、ND207 3R对ND207纯合体玉米基因组DNA进行PCR扩增,扩增产物测序分析,获得5'端旁侧序列262 bp和3'端旁侧序列316 bp,用ND207 5F、ND207 3R对受体玉米DNA进行PCR扩增,扩增产物测序分析,获得插入位点受体玉米基因组序列423 bp。将两端旁侧序列分别与受体玉米基因组序列进行比对(图2),5'端序列有153 bp和玉米基因组序列完全相同,109 bp为载体序列;3'端序列有240 bp 和玉米基因组序列完全相同,76 bp为载体序列。


2.2 ND207引物初筛

以ND207质量分数为1%的DNA为模板,采用表3的引物组合进行PCR扩增,选择目标条带长度在120~300 bp之间,扩增条带明亮没有拖尾,无非特异性扩增条带,生成引物二聚体较少的引物。由图3可知:3'-1、3'-2、3'-3、3'-4无扩增信号。3'-7、3'-8、3'-10、3'-11、3'-12、3'-13、3'-14、3'-15、5'-2、5'-3、5'-4、5'-6、5'-7、5'-8、5'-9有扩增信号,电泳目的条带较弱,5'-9引物二聚体较明显。5'-1、5'-5、3'-5、3'-6、3'-9、3'-16有扩增信号,电泳出现目的条带,无其他非特异条带,目的条带大小与预期相符,且条带清晰、明亮,可进行下一步筛选。


2.3 引物特异性筛选

为了筛选出只对ND207特异扩增的引物,提取阳性对照(质量分数为1%的ND207)、阴性对照(非转基因混合粉)、转基因玉米混样、转基因水稻混样、转基因油菜混样、转基因大豆混样、转基因棉花混样的基因组 DNA进行PCR扩增,对引物5'-1、5'-5、3'-5、3'-6、3'-9、3'-16进行特异性测试。由图4可知:3'-5、3'-6、3'-9均出现明亮不一的非特异条带;5'-1、5'-5、5'-16只在阳性对照中获得与预期目的条带一致的扩增条带。因此,5'-1、5'-5、3'-16可进行下一步筛选。


2.4 引物灵敏度筛选

灵敏度是指PCR反应能够检测到的目的基因最低含量。引物与模板的结合效率是影响PCR反应灵敏度的因素之一,在其他因素相同的条件下,设置ND207质量分数为10%、5%、1%、0.5%、0.1%的样品及空白对照进行PCR扩增,PCR产物电泳分析。由图5可知:5'-1、5'-5、3'-16在DNA模板1%及以上扩增条带明亮。5'-1、5'-5、3'-16在DNA模板0.5%扩增条带较弱,但清晰可辨。5'-1、5'-5在DNA模板0.1%扩增条带隐约可见,难以分辨;3'-16在DNA模板0.1%扩增条带清晰可见。因此,通过引物筛选,确定采用引物3'-16建立抗虫玉米ND207转化体特异性定性PCR检测方法,引物名称为:ND207-F/ND207-R,PCR产物大小为166 bp,满足农业部2259号公告-5-2015的要求[12]。


2.5 PCR反应体系和反应条件的优化

采用最佳引物ND207-F/ND207-R,对PCR反应的关键因子引物浓度及退火温度进行优化,设置0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 μmol L-1 6个引物浓度梯度,退火温度52℃、54℃、56℃、58℃和60℃ 5个温度梯度进行正交组合。由图6可知:引物浓度0.4~1.0 μmol L-1、退火温度为56~60℃范围,PCR反应都能获得较好的扩增。综合考虑与体系中其他标准方法的配合使用,优化的PCR反应体系见表4;优化的反应程序为:94℃变性5 min;94℃变性30 s,58℃退火30 s,72℃延伸30 s,共进行35次循环;72℃延伸5 min。


2.6 方法灵敏度测试

为了进一步测试优化的反应体系和反应条件下方法的灵敏度,设置7个浓度的样品及空白对照,分别为ND207质量分数10%、5%、2%、1%、0.5%、0.1%和0.05%。由图7可知:质量分数0.1%及以上的样品扩增条带典型,且可以清晰辨识,质量分数0.05%的样品扩增条带亮度显著下降,不能清晰辨认,空白对照无扩增条带。


2.7 方法检出限测试

根据灵敏度测试结果,综合考虑方法在使用时的稳定性和适用性,依据ENGL[14]对检出限测试的要求,随机抽取60份ND207质量分数为0.1%的样品进行测试。由图8可知, 60次反应全部扩出目的条带,由此可以确定普通PCR方法的检出限为0.1%,以反应体系中加入50 ng DNA模板进行测算,相当于20个拷贝的ND207特异分子片段。


2.8 方法再现性测试

方法的再现性是指在改变了测量条件的前提下,同一被测样品的测量结果之间的一致性。不同实验室由2个不同操作人员,用2台不同品牌的PCR仪,对30份样品进行测试,包括10份阳性样品(ND207质量分数为1%)、10份阴性样品(非转基因混合物)、10份检出限样品(ND207质量分数为0.1%)。由图9可知:外在条件改变不影响相同测试样品的检测结果,阳性样品电泳条带明亮;检出限样品电泳条带清晰可辨;阴性样品无扩增条带。表明方法具有较好的再现性。


2.9 方法的循环验证

为了充分验证方法的可行性,邀请8家已通过“双认证”的转基因生物安全检测机构对方法进行循环验证,8家单位分别对表5中11个样品进行ND207转化事件特异性定性PCR检测,每个样品6个平行。8家单位实验结果见表5,在阳性对照(ND207质量分数为100%)、1% ND207、0.1% ND207的样品中扩增出目的条带(+),其他样品中无扩增条带(–)。8家单位对方法的循环验证结果表明:本方法的主要技术参数(特异性、检出限、再现性)全部符合农业部2259号公告-5-2015[12]、ENGL[13]和SN/T 4561-2016[14]等相关标准的要求,可作为标准方法在检测行业推广应用。


3 讨论

转基因重大专项的实施开发了很多我国自主知识产权的转基因品种,目前大多品种已进入生产性试验,面临商业化推广。为了将这些新的转基因品种纳入到监管体系,研制转基因新品种的检测方法尤为重要。转基因玉米ND207是中国农业大学研发的转基因抗虫玉米新品种,根据研发单位提供的资料,研发者已经完成T-DNA的测序及染色体定位,建立了ND207的鉴定方法,但是研发者的鉴定方法没有经过方法测试,且扩增产物片段较大,在应用过程中可能会出现特异性差、灵敏度低及无法检出深加工食品等问题。本研究克隆插入位点的旁侧序列,避开了繁琐的巢式PCR方法[15]、TAIL-PCR方法[16,17]、基因组步移法[18]等常用方法,采用研发者提供的引物进行组合,PCR扩增产物进行测序,分别获得了插入位点的受体玉米DNA序列及ND207两端旁侧序列,通过序列比对,找到载体序列和受体玉米基因组序列的分界点。分别在载体序列和受体玉米基因组上各设计了7条引物,组合成25对引物组合进行PCR扩增,选取扩增效率好、特异性高、灵敏度好的引物进行方法建立。在方法建立过程中,通过设置引物浓度及退火温度梯度,找到最优化的PCR反应体系及反应条件,建立ND207的转化事件特异性定性PCR检测方法,PCR产物片段大小为166 bp。对方法的灵敏度进行测试,确立方法的检出限为0.1%,约为20个拷贝的ND207特异分子片段,远低于欧盟对转基因食品及饲料的标识最低限量0.9%[19],可满足日常的检测需要。


PCR技术在转基因成分检测领域的应用产生了大量的国家标准方法,转基因成分检测正在由定性向定量发展,由普通PCR向实时荧光PCR[20,21]和数字PCR[22,23]发展。目前,检测机构仍然以普通PCR定性筛查为主,如果检出阳性,再根据调控元件、标记基因、目的基因信息锁定转化事件,并进一步通过转化事件特异性定性PCR确认转化体身份。随着转基因植物安全监管政策的调整和科技进步,今后转基因成分检测将会逐步从定性检测过渡到定量检测,即采用实时荧光PCR和数字PCR的方法对转化体的含量进行定量。因此,本研究将继续研制ND207实时荧光PCR和数字PCR方法,为ND207及其衍生品系的安全监管提供技术支撑,进一步完善我国的转基因成分检测标准体系。


4 结论

通过对ND207插入位点的序列分析,获取了ND207插入位点两端旁侧序列,针对两端旁侧序列设计多对引物进行筛选,选取一对最佳引物优化PCR反应体系及反应条件,建立了ND207的转化事件特异性定性PCR检测方法,PCR产物片段大小为166 bp。经过测试,该方法的检出限为0.1%,约为20个拷贝的ND207特异分子片段。


致谢

感谢农业农村部科技发展中心为本方法的研发提供试验材料,并组织了方法的循环验证。农业农村部农作物生态环境安全监督检验测试中心(太原),农业农村部农产品及加工品质量安全监督检验测试中心(杭州),农业农村部农产品及加工品质量监督检验测试中心(长春),农业农村部农作物生态环境安全监督检验测试中心(合肥),农业农村部谷物及制品质量监督检验测试中心(哈尔滨),农业农村部农作物及产品成分监督检验测试中心(哈尔滨),农业农村部植物及植物用微生物生态环境安全监督检验测试中心(广州),农业农村部农产品及加工品质量监督检验测试中心(天津)参加了本方法的循环验证,特此致谢!


参考文献

[1] 吕山花, 常汝镇, 陶波, 李向华, 栾凤侠, 郭珊花, 邱丽娟. 抗草甘膦转基因大豆PCR检测方法的建立与应用. 中国农业科学, 2003, 36: 883-887.

[2] 查中萍, 万丙良, 殷得所, 杜雪树, 李进波, 夏明元, 戚华雄, 李园梦. 转<i>Cry1Ab</i>/<i>Cry1Ac</i>基因水稻TT51-1中外源基因多重PCR检测方法. 湖北农业科学, 2019, 58: 232-235.

[3] 常丽娟, 宋君, 雷绍荣, 尹全, 王东, 刘文娟, 张富丽. 转基因玉米MIR604 结构特异片段实时荧光定量检测方法的建立. 江苏农业学报, 2015, 31: 971-974.

[4] 李葱葱, 谢苹, 董立明, 夏蔚, 兰青阔, 闫伟, 龙丽坤, 李飞武. 抗虫耐除草剂玉米 GH5112E-117C 定性 PCR 检测方法. 生物技术通报, 2020, 36(5): 64-67.

[5] Wu G, Wu Y H, Nie S J, Zhang L, Xiao L, Cao Y L, Lu C M. Real-time PCR method for detection of the transgenic rice event TT51-1.<i> Food Chem</i>, 119: 417-422.

[6] Zhang F L, Song J, Niu B, Yin Q, Chang L J, Wang D. An event-specific qualitative and real-time PCR detection of 98140 maize in mixed samples. <i>Food Control</i>, 57: 1-8.

[7] 翟勇, 武玉花, 吴刚, 曹应龙, 卢长明. 转基因玉米MON88017转化事件特异性定性PCR检测方法及其标准化. 农业生物技术学报, 2010, 6: 1208-1214.

[8] 农业部1193号公告-3-2009. 转基因植物及其产品成分检测抗虫水稻TT51-1及其衍生品种定性PCR方法. 北京: 中国标准出版社, 2009.

[9] 农业农村部公告第111号-8-2018. 转基因植物及其产品成分检测耐除草剂玉米COO10.1.1及其衍生品种定性PCR方法. 北京: 中国标准出版社, 2018.

[10] 农业农村部公告第323号-4-2020. 转基因植物及其产品成分检测耐除草剂棉花MON88701及其衍生品种定性PCR方法. 北京: 中国标准出版社, 2020.

[11] 农业农村部公告第323号-5-2020. 转基因植物及其产品成分检测抗虫大豆MON87751及其衍生品种定性PCR方法. 北京: 中国标准出版社, 2020.

[12] 农业部2259号公告-4-2015. 转基因植物及其产品成分检测定性PCR方法制定指南. 北京: 中国标准出版社, 2015.

[13] ENGL. Definition of minimum performance requirements for analytical methods of GMO testing. European Network of GMO Laboratories, 2015.

[14] SN/T 4561-2016. 转基因检测非标方法确认评价指南. 北京: 中国标准出版社, 2016.

[15] 袁磊, 孙红炜, 杨崇良. 转基因玉米MON88017旁侧序列分析及定性PCR检测. 作物学报, 2010, 36: 361-364.

[16] 申爱娟, 陈 松, 周晓婴, 戚存扣. 转基因油菜W-4 T-DNA旁侧序列分析与事件特异性检测. 江苏农业学报, 2014, 30(1): 10-20.

[17] 张艳敏, 张红梅, 相金英, 郭秀林, 刘子会, 李国良, 陈受宜. 转 BADH 基因苜蓿 T-DNA 侧翼序列分析及转化事件特异性分析. 作物学报, 2011, 37: 397-404.

[18] 冯翠莲, 万玥, 冯小艳, 王俊刚, 赵婷婷, 王文治, 沈林波, 张树珍. 转基因甘蔗 BtG-2 的 T-DNA 侧翼序列分析及其转化事件特异性检测. 热带作物学报, 2021, 42: 2468-2477.

[19] Marmiroli N, Maestri E, Gulli M. Methods for detection of GMOs in food and feed. <i>Anal Bioanal Chem</i>, 2008, 392: 369-384.

[20] 农业部2122号公告-8-2014. 转基因植物及其产品成分检测抗虫水稻TT51-1及其衍生品种定量PCR方法. 北京: 中国标准出版社, 2014.

[21] 农业农村部公告第323号-10-2020. 转基因植物及其产品成分检测耐除草剂大豆GTS40-3-2及其衍生品种定量PCR方法. 北京: 中国标准出版社, 2020.

[22] GB/T 38132-2019. 转基因植物品系定量检测数字PCR法. 北京: 中国标准出版社, 2019.

[23] SN/T 5334.2-2020. 转基因植物产品的数字PCR检测方法 第二部分: 转基因大豆. 北京: 中国标准出版社, 2020.


相关文章
100%安全可靠
7X18小时在线支持
支付宝特邀商家
不成功全额退款