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截短适配体-荧光法检测水中双酚A研究

发布时间:2021-11-17 10:09:29

   要:目的 建立截短适配体-荧光法测定水中双酚A。方法 选择包含38个碱基的双酚A截短适配体为双酚A识别元件,在截短适配体的5'端修饰荧光基团6-FAM,在互补序列c DNA的3'端修饰淬灭基团DABCYL,配制双酚A及干扰物标准溶液,优化互补序列c DNA的碱基个数、截短适配体与互补序列cDNA的浓度比、孵育温度、孵育时间和缓冲液pH值,建立截短适配体-荧光法检测体系,进行特异性与回收率实验。结果 当互补序列cDNA包含9个碱基,截短适配体与互补序列cDNA的浓度比为1∶1.5,缓冲溶液p H值为7.5,55℃孵育60 min时,10~75 pmol/L浓度范围内,双酚A的线性关系较好,线性回归方程为y=2 230.7x+110 825,相关系数为0.926,检出限为3.3 pmol/L。四溴双酚A、雌二醇、雌三醇和双酚S等4种干扰物与双酚A的荧光强度差值区别较明显,对检测结果未造成明显干扰。当加标浓度为20.0、40.0和60.0 pmol/L时,回收率分别为97.8%、98.8%和102.3%,相对标准偏差分别为4.4%、2.1%和2.6%。结论建立的截短适配体-荧光法操作简便,灵敏度高,特异性强,可用于检测水中双酚A。
  
  
关键词:截短适配体 荧光法 检测 双酚A
  

  Determination of bisphenol A in water by truncated aptamer-fluorescence method

  

  XUE Chenchen ZHU Guangping BAI Jie WU Nanxiang FAN Hongliang
  
  School of Public Health, Hangzhou Medical College;

  
  
Abstract:ObjectiveTo establish a fluorescence method based on turncated aptamer for the determination of bisphenol A in water.MethodsThe bisphenol A truncated aptamer containing 38 bases was selected as a recognition module,and was modified with the fluorophore 6-FAM at the 5'end. The 3'end of the complementary sequence cDNA was modified with the quencher DABCYL. The standard solutions of bisphenol A and interfering compounds were configured.The detection system was established after optimizing the number of bases in c DNA, the concentration ratio of truncated aptamer to cDNA, the incubation temperature and time, and the p H of the buffer. The specificity and recovery experiments were carried out.ResultsWhen the complementary sequence c DNA included 9 bases, the concentration ratio of the truncated aptamer to cDNA was 1∶1.5, the p H value of the buffer solution was 7.5, the cDNA was incubated at 55℃for 60 minutes, in the concentration range of 10-75 pmol/L, the linear regression equation was y=2 230.7 x+110 825,the correlation coefficient was 0.926. The limits of detection was 3.3 pmol/L. The difference values of fluorescence intensity between tetrabromobisphenol A, estradiol, estriol, bisphenol S and bisphenol A were obviously different, so there was no significant interference to the test result. The recovery rates were 97.8%, 98.8% and 102.3% with the spiked concentrations of 20.0, 40.0 and 60.0 pmol/L. The relative standard deviations were 4.4%, 2.1% and 2.6%(n=5), respectively.Conclusion high sensitivity and specificity, which can be used for the determination of bisphenol A in water.
  
  
Keyword:truncated aptamer; fluorescence analysis; detection; bisphenol A;
  
  双酚A是一种典型的环境内分泌干扰物,常作为制造日常生活用品的原材料,主要通过皮肤、呼吸道和口腔进入人体,具有肝脏毒性、免疫毒性和生殖毒性,可引发跨代毒性效应,与某些恶性肿瘤的发病相关[1-3]。近年不断有研究报道在自然水体中检出双酚A[2-3]。双酚A的传统检测方法如液相色谱法[4]、气相色谱质谱联用法[5]和液相色谱质谱联用法[6]等,样品制备步骤复杂,需专业技术人员操作[7-8];而双酚A的新型检测方法荧光法具有操作简便、灵敏度高和响应速度快等优点[9-10]。核酸适配体是通过体外筛选获得的一段寡核苷酸序列,对待测物有较高的亲和力和特异性,常与其他方法结合检测双酚A[11]。截短适配体为剔除非必需结合序列后的核酸适配体,具有亲和力更高、灵敏度好、设计灵活多样和合成成本低的特点[12-14]。本研究采用双酚A截短适配体作为识别元件,通过荧光法将待测物的荧光强度信号转化为浓度信号,建立水中双酚A的检测方法。现报道如下。
  
  1 材料与方法
  
  1.1 仪器与试剂
  
  Spectra Max i D5微孔板检测仪(上海美谷分子仪器有限公司);Costar黑色底透96孔板(美国Costar公司);Mini-8KS低速离心机(杭州奥胜仪器有限公司);VORTEX-5漩涡混合器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司);Mag Q Milli Q超纯水仪(美国Millipore公司);H1650R低温高速离心机(湖南湘仪离心机仪器有限公司);FA1004N电子分析天平(上海精密科学仪器有限公司);Seven Excellence p H测试仪(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)。
  
  双酚A、双酚S、六水氯化镁(货号:A601336)、Tris-HCl溶液(1 mol/L,p H=7.5)、二甲亚砜(货号:A503039)、乙醇[95%,生工生物工程(上海)股份有限公司];雌二醇(98%)、氯化钠(货号:C111533)、氢氧化钠(货号:S140903,阿拉丁试剂有限公司);雌三醇(货号:S47654)、四溴双酚A(货号:S50851,源叶生物科技有限公司);氯化钾(≥99.5%,上海申博化工有限公司);盐酸(永华化学科技有限公司);超纯水(电阻率18.2 MΩ·cm);所有试剂均为国产分析纯,实验用水为超纯水。
  
  缓冲溶液:称取5.844 g氯化钠、7.455 g氯化钾和21.158 g六水氯化镁,分别溶于100 m L超纯水中,均配制成浓度为1 mol/L的标准溶液。取4 m L氯化钠溶液、7 m L氯化镁溶液和4 m L氯化钾溶液,加入6.5 m L Tris-HCl溶液,用超纯水稀释至50 m L(110 mmol/L Tris-HCl溶液,70 mmol/L氯化钠溶液,120 mmol/L氯化镁溶液,70 mmol/L氯化钾溶液,pH=7.5)。
  
  1.2 方法
  
  1.2.1 反应原理
  
  本研究在双酚A截短适配体的5'端修饰荧光基团6-FAM,互补序列cDNA的3'端修饰淬灭基团DABCYL。当不含双酚A时,截短适配体与互补序列cDNA遵循碱基互补配对原则,杂交形成双链结构,截短适配体5'端的荧光基团6-FAM与互补序列cDNA 3'端的淬灭基团DABCYL在空间上靠近,发生荧光共振能量转移,此时体系的荧光强度较低。双酚A加入后,可特异性结合截短适配体,互补序列cDNA与截短适配体分离,荧光基团6-FAM与淬灭基团DABCYL的空间距离增大,此时体系的荧光强度较高。根据加入双酚A前后引起的荧光强度差值定量检测双酚A。
  
  1.2.2设计寡核苷酸序列
  
  参考文献[15-16],选择含有38个碱基的双酚A截短适配体作为双酚A识别元件。研究表明,当互补序列cDNA的长度约为截短适配体的1/3时,上述反应更易发生[17-18],结合预实验结果,选择7~11个碱基作为互补序列cDNA的长度。在截短适配体的5'端修饰荧光基团6-FAM,互补序列cDNA的3'端修饰淬灭基团DABCYL。寡核苷酸委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成和纯化。见表1。
  
  表1 寡核苷酸序列
  
  1.2.3 寡核苷酸预处理
  
  合成的寡核苷酸于棕色EP管中储存并呈干膜状,4 000 r/min离心60 s,离心半径为10 cm。向EP管加入适量超纯水,于漩涡混合器震荡3~5 s,低速离心5~10 s,配制成浓度为10-4mol/L的寡核苷酸原液。取适量超纯水稀释至10-5mol/L,再取适量缓冲溶液继续稀释至10-6mol/L,置于-4℃或-20℃避光保存。
  
  1.2.4 配制双酚A、干扰物标准溶液
  
  称取0.002 3 g双酚A,0.002 9 g雌三醇,0.002 7 g雌二醇,0.002 5 g双酚S,各加入5 m L二甲亚砜;称取0.005 4 g四溴双酚A,加入5 m L乙醇,完全溶解后将上述溶液分别转移至100 m L容量瓶中,用超纯水定容至刻度线,分别配制成浓度为10-4mol/L的标准溶液。取适量超纯水将双酚A标准溶液稀释至10-9~10-11mol/L,将四溴双酚A、雌二醇、雌三醇和双酚S溶液分别稀释至2×10-9mol/L,备用。
  
  1.2.5 建立检测体系
  
  体系包含4种溶液:截短适配体溶液、互补序列c DNA溶液、超纯水和缓冲溶液。使用黑色底透96孔板进行反应,分为空白组和双酚A组,空白组加入10 m L超纯水,双酚A组加入10 m L适宜浓度的双酚A标准溶液。此外,每孔加入4 m L 10-6mol/L截短适配体溶液,6 m L 10-6mol/L互补序列c DNA溶液,适量缓冲溶液和超纯水。反应总体系为200 m L,设5组平行。将黑色底透96孔板置于微孔板检测仪中,震荡30~60 s,设置读板温度为55℃,避光孵育60 min,读板方式为终点法,激发波长485 nm,发射波长520 nm,读板方向为顶读,读板高度为14.3 mm。空白组的荧光强度记为F0,双酚A组记为F1,系列浓度双酚A标准溶液引起的荧光强度差值即为F1-F0。
  
  1.2.6 优化反应条件
  
  优化互补序列c DNA的碱基个数,截短适配体与互补序列c DNA的浓度比,孵育时的温度、时间以及缓冲溶液p H值。每项优化反应设置4~5组条件,检测体系的荧光强度,计算荧光强度差值,以荧光强度差值最大作为最佳条件的判定标准。
  
  1.2.7 特异性实验
  
  空白组不变,双酚A组依次加入10 m L 2×10-10mol/L双酚A标准溶液以及10 m L2×10-9mol/L四溴双酚A、雌二醇、雌三醇和双酚S标准溶液,检测荧光强度,计算荧光强度差值,对比双酚A及4种干扰物的结果。
  
  1.2.8 加标回收率
  
  取实验室自来水水样,设置5组平行,空白组不变,双酚A组依次加入10 m L4×10-10、8×10-10和1.2×10-11mol/L双酚A标准溶液,对应双酚A加标浓度分别为20.0、40.0和60.0 pmol/L,检测荧光强度,计算自来水中双酚A的回收率。
  
  2 结果
  
  2.1 优化反应条件
  
  2.1.1 互补序列c DNA的选择
  
  5组互补序列c DNA1、cDNA2、cDNA3、cDNA4和cDNA5对应的序列分别包含7、8、9、10和11个碱基,其中c DNA3的荧光强度差值最大,说明加入双酚A后该体系的荧光恢复程度最好,见图1。本研究以c DNA3为互补序列。
  
  2.1.2 截短适配体与互补序列c DNA的浓度比选择
  
  固定截短适配体的终浓度为2×10-8mol/L,按照1∶1、1∶1.2、1∶1.5、1∶2和1∶3的比例分别加入适量互补序列c DNA。随着互补序列c DNA的浓度增大,荧光强度差值先增大后减小;当互补序列c DNA浓度是截短适配体的1.5倍时,荧光强度差值最大,见图2。本研究以1∶1.5作为截短适配体与互补序列c DNA的浓度比。
  
  2.1.3 孵育温度和时间的选择
  
  固定截短适配体的终浓度为2×10-8mol/L,互补序列c DNA的终浓度为3×10-8mol/L,在25、35、45、55和65℃下避光孵育30、60、90和120 min。随着孵育温度的增高,荧光强度差值逐渐增大;当孵育温度超过55℃时,荧光强度差值减小,见图3。当孵育60 min时,荧光强度差值最大;当孵育超过60 min时,荧光强度差值减小,见图4。本研究以55℃避光孵育60 min作为孵育条件。
  
  2.1.4 缓冲溶液p H值
  
  当缓冲溶液p H值从7增加至7.5时,荧光强度差值逐渐增大;当缓冲溶液p H值从7.5增加至9时,荧光强度差值逐渐减小,见图5。本研究以7.5作为缓冲溶液的最佳p H值。
  
  2.2 线性关系
  
  在优化条件下,检测不同浓度双酚A在缓冲体系中的荧光强度。在10~75 pmol/L双酚A浓度范围内,线性方程为y=2 230.7x+110 825,相关系数为0.926,荧光强度差值与双酚A的浓度呈较好的线性关系,双酚A检出限为3.3 pmol/L。
  
  2.3 特异性
  
  4种类似物与双酚A的荧光强度差值区别较明显,即干扰物的测定结果未造成明显干扰,见图6。因此,本方法对双酚A具有较好的选择性。
  
  2.4加标回收率
  
  自来水水样中双酚A的本底值<3.3 pmol/L,当双酚A的加标量为20.0、40.0和60.0 pmol/L时,测定值分别为19.6、39.5和61.4 pmol/L,加标回收率分别为97.8%、98.8%和102.3%,相对标准偏差分别为4.4%、2.1%和2.6%。
  
  3 讨论
  
  本研究选择长度为38个碱基的双酚A截短适配体作为双酚A的识别元件,基于荧光能量共振转移原理,构建由6-FAM和DABCYL修饰的截短适配体与互补序列c DNA组合型截短适配体传感器。互补序列c DNA的长度为9个碱基,截短适配体与互补序列c DNA的浓度比为1∶1.5,缓冲溶液的p H值为7.5时,55℃孵育60 min为最佳实验条件。双酚A线性检测范围为10~75 pmol/L,检出限为3.3 pmol/L,自来水水样中双酚A加标回收率为97.8%~102.3%,相对标准偏差为2.1%~4.4%,可以满足GB 5749—2006《生活饮用水卫生标准》[19]规定的双酚A检测浓度要求。
  
  图1 不同互补序列cDNA的荧光强度差值
  
  图3 不同孵育温度的荧光强度差值
  
  图4 不同孵育时间的荧光强度差值
  
  图5 不同缓冲溶液p H的荧光强度差值
  
  LI等[21]使用长度为63个碱基的核酸适配体建立的磁性分离-荧光法可以检测水体中0.8~35 nmol/L的双酚A,最低检测限为0.2 nmol/L。顾翔源等[21]建立银纳米粒子比色法,线性范围为2.2~219 nmol/L,最低检测限为1.3 nmol/L。ZHANG等[22]建立纳米金比色法,线性检测范围为1.5~500 nmol/L,最低检测限为1.5 nmol/L。刘伟[23]建立小檗碱结合荧光法,线性检测范围为200~500μmol/L,最低检测限为87μmol/L。与既往文献相比,本研究建立的截短适配体-荧光法操作简便,灵敏度高,特异性强,花费成本较低,有效提高了双酚A检测能力。后续研究可在本研究的基础上结合信号放大机制的方法,或使用双酚A截短适配体的其余序列,进一步扩大双酚A的线性检测范围,提高灵敏度。
  
  图2 截短适配体与c DNA不同浓度比的荧光强度差值
  
  图6 双酚A及4种干扰物的荧光强度差值
  
  
参考文献
  
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