ECHS1基因在肝癌细胞迁移、侵袭及预后中的作用

　　摘    要：目的 探讨烯脂酰辅酶A水合酶短链1(Enoyl coenzyme A hydratase short chain 1,ECHS1)基因在肝癌细胞迁移及侵袭中的作用。方法 利用基因芯片技术筛选并分析肝癌差异表达基因；构建ECHS1干扰及过表达质粒检测对肝癌细胞迁移和侵袭的影响。利用TCGA数据库分析肝癌组织中ECHS1基因表达及其对预后影响。结果 肝癌显著差异表达基因214条，其中ECHS1表达最为显著；干扰ECHS1基因表达对肝癌细胞迁移、侵袭有显著抑制作用，ECHS1基因过表达后增强肝癌细胞迁移能力和侵袭能力；TCGA数据库分析显示较癌旁组织而言，肝癌组织中ECHS1高表达，且表达水平与肝癌预后相关。结论 ECHS1基因促进肝癌迁移和侵袭并可作为预后标志物。

　　关键词：原发性肝细胞肝癌 ECHS1 迁移 侵袭 预后

　　Role of ECHS1 in the migration, invasion and prognosis of liver cancer cells

　　YANG Qian YAO Yueying LIN Yuanyuan

　　Department of Clinical Medicine, Xiamen Medical College;

　　Abstract：Objective To investigate the role of human ECHS1 gene in the migration and invasion of liver cancer cells. Methods The differentially expressed genes in liver cancer were screened and analyzed by gene chip technique, and the effects of interference and overexpression ECHS1 plasmid detection on the migration and invasion of liver cancer cells were studied. Using TCGA database to analyze the expression of ECHS1 gene and its effect on prognosis in liver cancer. Results 214 differentially expressed genes were indentified in liver cancer, of which the expression of ECHS1 was the most significant. The interference of ECHS1 gene expression inhibited the migration and invasion of liver cancer cells, and the overexpression of ECHS1 gene enhanced the migration and invasion of liver cancer cells. TCGA database analysis showed that the expression of ECHS1 in liver cancer was higher than that in para-cancerous tissues, and the expression level was correlated with the prognosis of liver cancer. Conclusion ECHS1 promotes the metastasis and invasion of liver cancer and can be used as a prognostic marker.

　　Keyword：Primary liver cellular carcinoma; ECHS1; Metastasis; Invasion; Prognosis;

　　原发性肝癌是消化系统最常见恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率居高不下。现研究发现，肝癌的形成是多因素、多基因及多阶段的复杂过程，主要认为与癌基因激活、抑癌基因失活及各种生长因子表达失衡有关[1]。本研究采用8 064条人类靶基因的cDNA表达谱芯片对原发性肝细胞肝癌(primary liver cellular carcinoma, PLC)差异基因进行筛选和分析，发现烯脂酰辅酶A水合酶短链1(Enoyl coenzyme A hydratase short chain 1,ECHS1)基因在PLC中显著高表达。为进一步探讨该基因在PLC细胞迁移、侵袭中的作用，本研究依次干扰和过表达ECHS1基因观察对PLC恶性表型的影响，最后通过TCGA数据库分析ECHS1基因在肝癌组织中的表达及其对预后的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料来源

　　选取12例厦门医学院附属第二医院2019年2月至2020年5月经手术切除、术后病理证实为PLC患者的标本12例，男8例，女4例；年龄41.3～64.8岁；术后病理证实为PLC。所有患者术前均未行放化疗、生物治疗等，切除术后新鲜标本予生理盐水冲洗，标记后置于液氮中储存。肝癌细胞株HepG2购自中科院细胞资源中心并采用STR技术鉴定细胞。将HepG2细胞置于含有10%FBS的RPMI-1640培养基中培养，在37 ℃、体积分数为5%的CO2恒温细胞培养箱中培养。该研究征得患者及其家属书面同意，并通过伦理委员会批准(批号：LL2019002)。

　　1.2 芯片杂交

　　按Trizol法[2-3]提取肝癌及癌旁两组样本RNA,将两组RNA等量混合，予逆转录荧光标记，癌旁正常肝组织cDNA用Cy5-dUTP标记，而PLC组织cDNA用Cy3-dUTP标记。已标记过样品与含有8 064条人类靶基因芯片(购自深圳微芯生物公司)杂交，用Scan Array 4000扫描仪(General Scanning公司)对荧光图像扫描，信号以数据形式输出，5×108以上密度值芯片数据点视为有效，比值>2或<0.5的数据点为显著差异表达。

　　1.3 细胞转染

　　实验分为对照组(Control)和干扰组(siRNA)组；过表达组分为空白对照组(Vector)和过表达组(ECHS1)。购置ECHS1干扰及过表达质粒，转染前1 d, 取对数生长期HepG2细胞接种在培养板中，待培养至细胞汇合度达80%左右，根据说明书采用Lipofectamine 2000进行转染。

　　1.4 qRT-PCR检测

　　采用SYBR GreenPCR Master Mix 进行PCR扩增，ECHS1的PCR上游引物序列为5′-CTGGAATACGGATGCTA-3′,下游引物序列为5′-GACGTACTGCCTGCTTCAT-3′;内参照18S的PCR上游引物序列为5′-CCAGCTAACCGCCTGGATGGA-3′,下游引物序列为5′-GCGCCGTACTGCAAGCCCC-3′。PCR反应条件为95 ℃ 30 s、95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s, 共40个循环。

　　1.5 Western blotting检测

　　按蛋白提取试剂盒操作步骤提细胞总蛋白，使用BCA法对提取总蛋白进行定量并行SDS PAGE操作。选择恒压电泳：80 V恒压电泳30 min, 直至溴酚蓝指示剂达分离胶后更换为100 V恒压电泳，待溴酚蓝刚至胶底即可终止，将凝胶转膜至PVDF膜；孵育抗进行免疫印记。

　　1.6 划痕实验检测细胞迁移能力

　　将对数期HepG2细胞接种6孔培养板上，置于37 ℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养；待细胞融合达85%时，采用无菌PBS液沿培养皿侧壁冲洗细胞3次，洗去划下细胞。加入不含血清培养基置于37 ℃孵箱中孵育，于划痕后0、6、24和48 h取样，拍照。

　　1.7 Transwell检测细胞侵袭能力

　　检测小室加入2滴无血清培养基，弃去上室中浸膜用培养基，每个上室中加入200 μl的单细胞悬液，每个下室中加入600 μl完全培养基，每组细胞做6个小室；在培养箱中孵育30 h后，取出小室，用棉签拭去上室的细胞，PBS洗涤1次，4%多聚甲醛固定5 min, 苏木素溶液染色10 min; 切去小室膜，置于载玻片上，计数。

　　1.8 TCGA数据库挖掘

　　数据资料收集从TCGA 数据库中下载并预处理肝癌数据集中423例的mRNA表达RNASeqV2数据(2006年1月1日至2019年12月31日)。同时在TCGA数据库中下载371例肝癌患者癌组织以及50例癌旁正常肝组织临床数据。对肝癌组织和正常肝组织ECHS1表达量分析。生存分析选取数据集中包含预后随访完整数据病例，采用Kaplan-Meier模型对ECHS1高低表达生存期进行分析。

　　1.9 统计学分析

　　采用SPSS 22.0(SPSS, Inc. Chicago)统计软件进行数据处理与分析，两组定量资料比较采用t检验，以明确两组之间表达差异，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 总RNA抽提结果及基因芯片检测

　　本实验芯片杂交扫描图背景均一、荧光信号强度高，两组样本总RNA完整性好。本研究结果真实、可靠，符合重复性和可靠性的要求(见图1、表1)。

　　图1 PLC及癌旁组织芯片杂交信号扫描图

　　Fig 1 Microarray scanned data from PLC tissues and adjacent tissues

　　注：X轴以Cy5荧光强度前景值为坐标，Y轴以Cy3荧光强度前景值为坐标，每一个数据点代表芯片上一个基因的杂交信号。

　　表1 PLC及癌旁组织总RNA的相关数据

　　2.2 PLC显著差异表达基因

　　PLC与癌旁正常肝组织之间差异表达基因共214个，前21条基因参与脂肪酸代谢、糖代谢、无氧糖酵解等通路，大多表达上调，且ECHS1表达最为显著(见表2)。

　　2.3 干扰ECHS1表达抑制肝癌细胞迁移和侵袭能力

　　为明确ECHS1基因对肝癌细胞迁移及侵袭能力，本研究在ECHS1高表达肝癌细胞HepG2中进行了ECHS1-siRNA转染并进行了表达鉴定(见图2A)。Transwell检测显示，干扰ECHS1基因表达可抑制肝癌细胞HepG2迁移能力(见图2B),侵袭能力(见图2C)。

　　表2 PLC显著差异表达的肿瘤相关基因

　　图2 干扰ECHS1表达对肝癌细胞HepG2迁移和侵袭能力的影响

　　Fig 2 Effects of ECHS1 on the migration and invasion of HepG2 cells

　　注：A:qRT-PCR和Western blotting检测ECHS1基因干扰后表达情况；B:干扰ECHS1基因后对HepG2细胞迁移能力的影响(放大 40倍);C:干扰ECHS1基因表达对HepG2侵袭能力的影响(放大40倍)

　　2.4 过表达ECHS1基因可促进肝癌细胞的迁移能力和侵袭能力

　　为进一步证实ECHS1基因在肝癌转移中有促进作用，本研究过表达ECHS1基因观察对HepG2细胞迁移、侵袭能力的影响。对转染阳性克隆细胞进行筛选及表达鉴定(见图3A)。Transwell检测显示，过表达ECHS1基因促进肝癌细胞HepG2迁移能力(见图3B～3C)。

　　图3 ECHS1过表达对肝癌细胞HepG2迁移、侵袭能力的影响

　　Fig 3 Effect of over-expression of ECHS1 on migration and invasion of HepG2

　　注：A:qRT-PCR和Werstern blotling分析过表达后ECHS1基因表达变化；B:Transwell实验分析ECHS1基因过表达对 HepG2迁移能力的影响(放大40倍),**P<0.05;C:ECHS1基因过表达对HepG2侵袭能力的影响(放大40倍)。

　　2.5 ECHS1表达与肝癌患者预后分析

　　在TCGA公共数据库中的肝癌队列里进一步研究ECHS1表达高低与预后的关系。肝癌组织中ECHS1表达显著高于癌旁正常肝组织，差异有统计学意义(t=9.14,P<0.01)。ECHS1表达肝癌患者预后相关性ECHS1表达水平与肝癌患者预后相关，表达越高预后越差(P=0.043,见图4)。

　　图4 ECHS1表达与TCGA数据库肝癌患者预后关系

　　Fig 4 Relationship between expression of ECHS1 and prognosis of liver cancer patients in TCGA database

　　注：A:TCGA数据库肝癌组织与癌旁正常组织中ECHS1基因表达比较；B:ECHS1表达高低与肝癌患者预后关系。

　　3 讨论

　　PLC是常见的消化系统恶性肿瘤之一，发病机制尚未明确。随着对肿瘤致病机制的不断深入研究发现原发性肝癌是一种复杂的多基因、多步骤的生物学过程[4]。本研究利用DNA芯片的高通道、简捷等优点筛选PLC与其癌旁正常肝组织中差异表达基因，筛选出最为显著差异表达的基因ECHS1。该基因参与脂肪酸代谢，而肝脏是脂肪酸代谢极为活跃的场所[5-6]。目前诸多研究发现肝癌脂肪酸代谢表达上调参与了肝癌的发生发展[7-9]。本研究发现，立足于前期研究基础之上采用cDNA芯片技术挖掘到脂肪酸分解代谢的关键基因ECHS1,为PLC早期临床诊断及治疗提供重要理论依据。

　　本研究共筛选出PLC差异表达基因共214个，进一步分析显示前21条基因主要参与脂肪酸代谢、糖代谢、无氧糖酵解等通路，这些通路与肝癌发生发展密切相关[10-13]。挑选出最为显著基因ECHS1进一步研究在肝癌细胞迁移及侵袭中的作用。ECHS1基因参与了多种组织发育、细胞分化和器官形成[14]。研究通过先后干扰及过表达ECHS1基因，转染肝癌细胞株HepG2后显示干扰ECHS1后肝癌细胞迁移、侵袭能力降低，过表达该基因后可显著促进HepG2迁移、侵袭能力。这些获得性和丢失性功能性实验结果证明了ECHS1基因在肝癌中是一个重要的转移促进基因。为确定ECHS1基因表达在肝癌患者中的临床特征，本研究首先下载TCGA 数据库中肝癌RNASeq数据集、病例临床数据和预后数据。通过对肝癌组织和癌旁正常肝组织中ECHS1表达量比较分析发现，ECHS1在肝癌组织中明显高表达，提示ECHS1可能是肝癌中的一个重要的促癌基因。进一步分析ECHS1与肝癌患者临床特征的关系，生存曲线分析表明，高表达ECHS1的肝癌患者明显预后不良。细胞功能实验联合TCGA数据库分析显示ECHS1基因在肝癌中是一个明显的促癌基因，且很可能促进肝癌的转移过程进而导致预后极差。

　　综上所述，脂肪酸分解代谢关键基因ECHS1激活肝癌细胞的迁移和侵袭能力，促进肝癌的远处转移，最终影响肝癌患者的生存时间。本研究为阐明肝癌发病分子机理提供重要理论基础。

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