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大蒜素通过抑制内质网应激减轻心肌缺血再灌注损伤的实验研究

发布时间:2022-03-07 17:24:08

  摘    要:目的:探讨大蒜素对大鼠心肌缺血再灌注(MIR)损伤的保护作用及内质网应激(ERS)的影响。方法:通过夹闭左冠状动脉前降支30 min复制MIR大鼠模型,实验设假手术组、模型组、大蒜素低(5 mg/kg)、中(10 mg/kg)、高(20 mg/kg)剂量组,每组各20只。成模后,大蒜素各剂量组腹腔注射给药,假手术组和模型组给予生理盐水,每天1次,连续给药28 d。HE染色法行心肌病理学检查并进行心肌损伤评分,TUNEL法检测心肌细胞凋亡,ELISA法检测心肌炎症因子含量; Western blot法检测ERS和细胞凋亡相关蛋白表达。结果:与模型组比较,大蒜素中、高剂量组大鼠心肌纤维断裂、细胞数量减少、中性粒细胞浸润等病变和细胞凋亡状况明显改善,心肌损伤评分和凋亡指数(AI)降低,心肌组织肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)含量降低,心肌糖调节蛋白78(GRP78)、磷酸化c-Jun氨基末端激酶(p-JNK)、增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)、激活型半胱氨酸蛋白酶-12(Cleved Caspase-12)、Cleved Caspase-3、核因子-κB(NF-κB)蛋白表达明显下调,差异均有统计学意义(P <0.05或P <0.01)。结论:大蒜素对MIR损伤具有一定保护作用,其机制可能与抑制ERS相关炎症和细胞凋亡通路有关。

  

  关键词:大蒜素;内质网应激;心肌缺血再灌注;心功能;病理学;炎性因子;细胞凋亡;大鼠;

  

  作者简介:*徐立,E-mail:zhjkqjx@163.com;

  

  收稿日期:2021-03-21

  

  Effects of Allicin on Myocardial Ischemia-Reperfusion Injury by Inhibiting

  

  Endoplasmic Reticulum Stress

  

  LI Hongxia YU Feihu DAI Xiaolan XULi CHEN Xiaoli

  

  No.906 Hospital

  

  Abstract:Objective: To investigate the effects of Allicin on myocardial ischemia-reperfusion( MIR) injury and endoplasmic reticulum stress in rats. Methods:MIR rat models were made by clamping the left anterior descending branch of coronary artery for 30 minutes; experiment was divided into sham operation group,model group,Allicin low( 5 mg/kg),medium( 10 mg/kg)and high( 20 mg/kg) dose group,each contained 20 rats. After model making,Allicin groups were given Allicin by intraperitoneal injection once a day for 28 d,while the sham operation group and model group were given the same volume saline. The histopathological changes was observed by HE staining and injury score was calculated; the cardiomyocyte apoptosis was detected by TUNEL; the expressions of endoplasmic reticulum stress-related and apoptosis-related protein were detected by Western blot. Results: Compared with model group,the rats in Allicin medium and high dose groups,the myocardial fiber rupture,cell number reduction,inflammatory cell infiltration and cell apoptosis were significantly improved,the injury score and AI were decreased; the expressions of GRP78,p-JNK,CHOP,Cleved Caspase-12,Cleved Caspase-3,NF-κB were significantly down-regulated; all of the difference were significant( P < 0. 05 or P < 0. 01). Conclusion: Allicin has a certain protective effect on MIR injury,which mechanism may be related to the inhibition of endoplasmic reticulum stress-related inflammation and apoptosis pathways.

  

  Keyword:Allicin; endoplasmic reticulum stress(ERS); myocardial ischemia-reperfusion(MIR); cardiac function; pathology; inflammatory factor; apoptosis; rat;

  

  随着冠状动脉粥样硬化性心脏病患病率的升高,由其引发的心肌梗死发病率呈逐年上升趋势[1]。及早有效治疗使血流再通是临床上抢救心肌梗死患者的关键[2],但血流再灌注过程往往导致心肌二次损伤,即心肌缺血再灌注(myocardial ischemia reperfusion,MIR)损伤。病理生理学研究发现,炎症反应和细胞凋亡与MIR损伤密切相关,而内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)是诱导炎症反应和细胞凋亡的重要信号通路[3,4]。大蒜素是由植物大蒜鳞茎中提取的一种三硫代烯丙醚类化合物,具有良好的抗炎活性及抑制肾缺血再灌注、小肠缺血再灌注所致的细胞凋亡作用[5,6,7]。本研究通过制备MIR大鼠模型并给予大蒜素进行干预,探讨大蒜素对内质网应激的影响及对MIR损伤的作用。

  

  1 材料与方法

  

  1.1 实验动物

  

  健康雄性SD大鼠100只,SPF级,7周龄,体质量220~240 g,由河北省实验动物中心提供,许可证号:SCXK(冀) 2018-004。饲养条件:室温23~25℃、相对湿度55%~65%、光照黑暗各12 h交替,实验前12 h禁食、自由饮水。严格按照本院动物伦理委员批准的实验方案执行。

  

  1.2 实验药物与主要试剂

  

  大蒜素注射液:徐州莱恩药业有限公司,批号:20200825。肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)酶联免疫(ELISA)试剂盒和TUNEL试剂盒:南京建成生物工程研究所,批号:200630、200509、200426;糖调节蛋白78 (GRP78)、磷酸化c-Jun氨基末端激酶(p-JNK)、增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)、激活型半胱氨酸蛋白酶-12(Cleved Caspase-12)、Cleved Caspase-3、核因子-κB(NF-κB)、β-actin抗体:北京博奥森生物技术有限公司,批号:bs-1219R、bs-2592R、bs-20670R、bs-23014R、bsm-52289R、bs-3543R、bs-12581R。

  

  1.3 主要仪器

  

  RT-6100型酶标仪:美国Rayto公司;RT-6100型酶标仪:美国Rayto公司;1659001型电泳仪、1703940型转膜仪:美国BioRad公司。

  

  1.4 动物分组、模型制备与给药

  

  将100只大鼠随机分为假手术组、模型组和大蒜素低、中、高剂量组,每组各20只。模型组和大蒜素低、中、高剂量组参照胡珍等[8]报道的方法,通过夹闭左冠状动脉前降支30 min复制MIR大鼠模型。造模成功判断标准:夹闭血管后,通过心电图机监测ST段弓背持续抬高或T波高耸;假手术组行手术通路但不夹闭血管。造模完成后,大蒜素低、中、高剂量组分别腹腔注射给予浓度1、2、4 g/L的大蒜素溶液(注射体积5 m L/kg),假手术组、模型组腹腔注射给予生理盐水(注射体积5 m L/kg),1次/天,连续给药28 d。

  

  1.5 观察指标及测定方法

  

  1.5.1 心肌病理学和细胞凋亡观察

  

  随机取各组10只大鼠,麻醉后开胸取心脏,取左心室心肌组织10%中性甲醛溶液固定72 h后包埋处理,经石蜡切片机切片(厚度5μm)和脱蜡处理后,取部分切片行HE染色后显微镜观察心肌病理学改变。心肌损伤评分:正常心肌计0分,根据病变灶视野比例≤1/4、1/4~1/2、≥1/2分别计1、2、3分,由变性坏死、出血、间质水肿、中性粒细胞浸润4个方面进行评分后相加。剩余切片经TUNEL染色后通过显微镜观察心肌细胞凋亡状况;计算凋亡指数(AI),AI(%)=(凋亡细胞数/细胞总数)×100%

  

  1.5.2 心肌组织炎症因子含量检测

  

  取各组剩余10只大鼠的左心室心肌,加入冷裂解液后研磨匀浆,4℃离心(3 000 r/min、10 min)取上清液,参照ELISA试剂盒操作说明检测炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6含量。

  

  1.5.3 心肌组织GRP78、p-JNK、CHOP、Cleved Caspase-12、Cleved Caspase-3、NF-κB蛋白表达检测

  

  取左冠状动脉前降支血流供应区的左心室缺血区心肌组织200 mg,研磨匀浆液,4℃、12 000r/min低温离心30 min取上清液,检测总蛋白浓度,采用Western blot法检测GRP78、p-JNK、CHOP、Cleved Caspase-12、Cleved Caspase-3、NF-κB蛋白表达。SDS-PAGE凝胶电泳、转PVDF膜、室温封闭1 h后滴加GRP78、p-JNK、CHOP、Cleved Caspase-12、Cleved Caspase-3、NF-κB、β-actin一抗4℃孵育过夜,二抗37℃孵育1 h,然后滴加DAB显色剂,通过条带灰度值以β-actin为内参半定量目标蛋白相对表达量。

  

  1.6 统计学处理

  

  采用SPSS 15.0统计软件包进行分析,实验数据以表示,多组间比较行one-way ANOVA,进一步两两比较行LSD-t检验,P<0.05为具有统计学意义。

  

  2 结果

  

  2.1 大蒜素对MIR大鼠心肌组织病理学改变的影响

  

  假手术组大鼠心肌组织未见异常。模型组可见心肌纤维排列紊乱、部分断裂,细胞膜破裂,胞核偏移深染,大量中性粒细胞浸润等病理改变。大蒜素低、中、高剂量组大鼠心肌组织病理学改变较模型组有不同程度改善;其中大蒜素高剂量组心肌纤维断裂现象明显减轻、中性粒细胞浸润明显减少。见图1。模型组大鼠心肌组织损伤评分较假手术组显著升高(P<0.01);大蒜素中、高剂量组损伤评分较模型组显著降低(P<0.01)。见图1,表1。

  

  2.2 大蒜素对MIR大鼠心肌细胞凋亡的影响

  

  见图2,表1。

  

  表1 各组大鼠心肌组织损伤评分和心肌细胞AI比较

  

  2.3 大蒜素对MIR大鼠心肌组织炎症因子含量的影响

  

  见表2。

  

  2.4 大蒜素对MIR大鼠心肌组织GRP78、p-JNK、CHOP蛋白表达的影响

  

  见图3、表3。

  

  表2 各组大鼠心肌组织炎症因子含量的比较

  

  2.5 大蒜素对MIR大鼠心肌组织Cleved Caspase-12、Cleved Caspase-3、NF-κB蛋白表达的影响

  

  见图4、表4。

  

  大蒜为药食两用植物,其鳞茎具有行滞气、消积、解毒、杀虫等功效。近代药理学研究发现,大蒜鳞茎中提取的大蒜素具有抗炎、抗细胞凋亡等多种药理学作用,并且大蒜素能够通过抑制内质网应激减轻巨噬源性泡沫细胞凋亡和血管内皮细胞凋亡[9,10]。血清NT-proBNP水平能够反映心功能状况,可做为心功能降低的早期诊断指标[11]。本研究发现,大蒜素能够明显减少MIR大鼠心肌纤维断裂、抑制细胞数量减少和中性粒细胞浸润等病变,降低心肌损伤评分,减少心肌细胞凋亡,说明大蒜素对大鼠MIR损伤具有保护作用。

  

  内质网是一种膜性细胞器,普遍存在于真核细胞中,内质网应激(ERS)是调控炎症反应、细胞凋亡的重要病理通路。既往朱平均等[12]和兰卓等[13]报道MIR能够诱发ERS并加重MIR损伤。过度ERS将破坏蛋白合成流程,导致蛋白不折叠或折叠错误并蓄积于内质网,诱发GRP78、p-JNK表达上调,所以二者可作为ERS检测指标[14,15]。CHOP是存在于内质网细胞器的一种促凋亡信号分子,能够剪切激活Caspase-12,而激活型Cleved Caspase-12(Cleved Caspase-12)是Caspase-3的活化刺激因子,进而激活细胞凋亡流程,而ERS可诱导CHOP上调表达[16,17]。NF-κB能够诱导TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性因子生成与释放,既往研究证实下调NF-κB表达能够抑制MIR大鼠炎症反应[18,19]。本研究发现,大蒜素可以显著下调MIR大鼠ERS相关蛋白(GRP78、p-JNK、CHOP)和凋亡相关蛋白(Cleved Caspase-12、Cleved Caspase-3、NF-κB)表达,降低心肌组织炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6含量;这可能是大蒜素对MIR损伤具有保护作用的重要分子机制。

  

  综上所述,大蒜素对MIR损伤具有一定抑制作用,其机制可能与抑制ERS信号通路及其诱发的炎症反应和细胞凋亡有关。

  

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