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甘参复方抗肝纤维化作用机制的代谢组学研究

发布时间:2022-11-08 09:00:19

摘    要:目的该研究旨在从内源代谢物的角度阐明GUSM抗肝纤维化的作用机制。方法皮下注射CCl4溶液建立肝纤维化大鼠模型。通过肝形态学指标和HE染色评价GUSM的疗效。利用超高效液相色谱-飞行时间质谱技术,通过主成分分析、正交偏最小二乘判别分析法对正常组、模型组、GUSM组和阳性对照组大鼠的代谢物谱进行分析、筛选和鉴定。结果共筛选和鉴定出16个与肝纤维化相关的潜在生物标志物。其中,牛磺胆酸、亚油酸、花生四烯酸等对肝纤维化进程影响较大。结论甘参复方主要通过调节亚油酸和花生四烯酸的代谢,发挥抗HF作用。本研究有助于从代谢组学角度了解和分析GUSM抗HF的作用机制。


关键词:甘参复方;代谢组学;超高效液相色谱-飞行时间质谱;肝纤维化;


Metabolomic study on the mechanism of anti-hepatic fibrosis of glycyrrhiza uralensis-

salvia miltrorrhiza prescription

HOU Yujao ZHANG Jie ZHAO Chaoyang XU Tianjiao LI Meiqian HONG Bo LI Wenjing

School of Pharmacy, Qiqihar Medical College


Abstract:Objective The purpose of this study is to comprehensively elucidate the anti-hepatic fibrosis mechanism of GUSM from the perspective of endogenous metabolites. Methods Hepatic fibrosis rat model was established by subcutaneously injecting CCl4 solution. The efficacy of GUSM was evaluated by liver morphological indexes and HE methods. We analyzed, screened and identified the metabolic profiles of rats from Normal group, Model group, GUSM group and Positive group by PCA and OPLS-DA method using UPLC-TOF-MS. Results A total of 16 potential biomarkers in both positive and negative mode associated with hepatic fibrosis were screened and identified. The metabonomics analysis revealed that Taurocholic acid, Glycocholic acid, Arachidonic acid, and so on were greatly disturbed. Conclusions GUSM prescription showed anti fibrosis effect on rats through regulating metabolic pathways, mainly about Arachidonic acid metabolism. This study is useful to better understand and analyze the anti hepatic fibrosis mechanism of GUSM prescription on HF rats using metabonomics.


Keyword:glycyrrhiza uralensis-salvia miltrorrhiza prescription; metabonomics; UPLC-TOF-MS; hepatic fibrosis;


肝纤维化(hepatic fibrosis,HF)是一种发病机制复杂的慢性流行性肝病[1,2]。虽然肝纤维化的治疗有一些显著进展,但仍有近一半的患者会发展为肝硬化[3]。中医在逆转肝纤维化的发展中显示出一定优势[4,5]。越来越多的研究者利用中医药的整体性、多组分、多靶点的特点来治疗肝纤维化[6,7,8]。


甘参复方(Glycyrrhiza Uralensis and Salvia Miltrorrhiza,GUSM)是由丹参与甘草组成的益气、和血、柔肝方剂[9,10,11]。其主要活性成分为芍药内酯苷、芍药苷、芹糖甘草苷、甘草苷、迷迭香酸、苯甲酰芍药苷、甘草酸、丹参素、二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮ⅡA、丹酚酸B等[12,13,14,15]。临床研究表明,GUSM广泛应用于肝纤维化的预防性治疗[16,17]。作为传统的中药,甘草常用于急、慢性肝炎的治疗[18,19];丹参用于慢性肝炎的治疗[20,21]。GUSM的疗效评价主要集中于动物药效实验或临床观察,尚未从内源物质代谢的角度来研究GUSM的机制。


为阐明GUSM复方抗肝纤维化的作用机制,本研究采用超高效液相色谱-飞行时间质谱(UPLC-TOF-MS)技术的代谢组学方法开展GUSM提取物抗HF大鼠的血清代谢组学研究,将所鉴定的潜在生物标志物进行相关分析,并探讨其代谢途径,以期为GUSM抗HF的作用机制提供实验依据。


1 材料和方法

1.1 实验动物

雄性SD大鼠购自辽宁省长生生物有限公司[SCXK(辽)2020-0001],共50只,SPF级,8~10周龄,体重200~240 g。饲养单位为齐齐哈尔医学院动物实验中心[SYXK(黑)2016-001],所有实验均遵守齐齐哈尔医学院实验动物管理规定和《实验动物管理与使用指南》。本实验经齐齐哈尔医学院动物实验中心伦理委员会批准(QMU-AECC-2022-13),实验过程遵循3R原则。


1. 2 主要试剂与仪器

中药复方制剂(批号:20190721)由中药汤剂实验室研制而成;甘草(批号:20180525)产于新疆,丹参(批号:20180914)产于四川,均购自哈尔滨市润禾中药饮片加工厂,经齐齐哈尔医学院药学院郭丽娜教授鉴定为豆科植物甘草和唇科植物丹参;秋水仙碱片(批号:120994,包装规格0.5 mg × 100)产于昆明制药集团股份有限公司。甲醇(色谱纯,批号:348604)、乙腈(色谱纯,批号:142085),均购自美国Fairfield试剂有限公司;甲酸(色谱纯,批号:095224,Dikma公司,美国);纯净水(批号:20180521,杭州娃哈哈集团有限公司,杭州);欧丽薇兰橄榄油(批号F20160814,益海嘉里食品营销有限公司,上海);CCl4(批号:20181204,阿拉丁生化科技股份有限公司,上海)。


SCIEX Triple TOFR 4600 AB ACQUITY超高效液相色谱(UPLC)系统(AB公司,美国);Micromass Quattro Micro API质谱仪(AB公司,美国);ST8R冷冻离心机(Thermo Fisher公司,美国);AL204微量分析天平(Mettler Toledo公司,瑞士)。


1.3 方法

1.3.1 UPLC-TOF-MS分析

超高效液相色谱(UPLC)系统与质谱仪联用,进行UPLC-TOF-MS分析。UPLC分析系统采用Waters ACQUITY UPLC HSS T3液相色谱柱(2.1 mm × 100 mm,1.7 µm);柱温40℃;进样温度4℃;流动相由含有0.1%甲酸的水(A)和含有0.1%甲酸的乙腈(B)组成;梯度洗脱,血清的梯度洗脱时间为12 min(表1);流速0.4 mL/min;进样量5 µL。在血清分析中,采用TOF-MS方法进行鉴定,获取较多的代谢物信息。离子源为电喷雾离子源,正、负离子检测模式;采集范围m/z 50~1200;毛细管电压:2.5 kV(正离子模式)/ 2.2 kV(负离子模式);喷雾气流量和锥孔气流量500 L/h和50 L/h;锥孔电压:正模式为25 V,负模式为40 V;离子源温度:530℃。


表1 超高效液相色谱法分析血清梯度洗脱程序


1.3.2 动物实验

将大鼠随机分为4组(每组10只):健康对照组(正常组:A)、HF模型组(模型组:B组)、GUSM治疗组(GUSM组)和秋水仙碱治疗组(阳性组:D)。


HF模型建立及给药方案[22,23]:通过皮下注射50% CCl4橄榄油溶液建立HF模型大鼠,每周2次(周一和周三),每次0.6 mL,连续12周。正常组皮下注射等剂量生理盐水,其余操作同模型组。在建立HF模型的同时,GUSM组大鼠给予GUSM灌胃,每日1次;阳性组,给予秋水仙碱溶液灌胃0.5 mL(由秋水仙碱片剂13.44 mg和水168 mL混合而成)。正常组和模型组灌胃相同剂量的生理盐水。


肝纤维化大鼠模型的评价:(1)一般情况:12周后通过大观察大鼠一般症状和体征。包括体重、精神状态、尿量等。(2)血清ALT、AST水平。(3)肝病理形态学变化。


肝纤维化大鼠模型成功建立的主要标准:(1)一般情况:精神萎靡、尿量减少、体重增长缓慢。(2)肝组织损伤指标检查:血清ALT、AST水平均显著升高。(3)组织病理学检查:肝颜色变为暗红、质地变硬、表面凹凸不平,呈小颗粒状改变;光镜下观察可见纤维间隔,肝小叶结构紊乱。


1.3.3 GUSM提取物的制备

分别准确称取丹参、甘草干燥根茎粉末(过20目筛)各10 g,混合。混合物在60℃下用200 mL 50%乙醇提取,每次提取1 h,过滤,重复两次。两次提取液合并,减压浓缩至200 mL,最终浓度为0.1 g/mL。GUSM提取物的特征指纹图谱如图1所示。


1.3.4 生物样品采集与处理

灌胃给药12周后,麻醉,肉眼观察剥离的肝组织。从眼眶静脉采集血样,在非肝素化试管中4℃放置2 h。4℃,3500 r/min离心10 min后分离出血清样品。将所有血清样品转移至洁净试管中,置于-80℃冰箱中冷冻保存。将大鼠肝左叶固定于4%中性多聚甲醛溶液中。分析前将血样在室温下重融,取200 μL分别置于EP管中,加入3倍量的色谱级甲醇沉淀蛋白,涡旋1 min。4℃下,12000 r/min离心12 min。取上清液通过0.22 μm微孔滤膜过滤,在UPLC-TOF-MS分析的正、负离子模式下注入5 μL制备好的血样并分析。用于验证该方法的QC样品的制备是从血清样品中各吸取50 μL。然后用上述制备方法处理混合后的样品。


1.3.5 肝功能指标及肝病理检测

据试剂盒的说明,测量并计算血浆谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)的水平。取肝组织(1.5 cm × 1 cm),用4%中性多聚甲醛溶液固定24 h。正常组织切片经苏木精(HE)染色后镜下观察。2.0 cm × 2.0 cm × 0.5 cm肝组织用10%福尔马林溶液固定。脱水透明后将组织包埋在融化的石蜡中,在载玻片上固化后切成4~6 µm宽的正方形。将载玻片放置在玻片架上进行脱蜡、染色与脱水处理。最后在玻片上滴1~2滴中性胶,盖玻片密封,晾干。


1.3.6 代谢组学方法验证

使用QC样品对仪器精密度、方法重复性、制备后稳定性、冻融过程和系统稳定性进行检测。仪器的精密度和方法的重复性是通过对相同QC样品和通过相同制备程序的6个不同的QC样品进行进行6次重复进样来评估。用6个新制备的QC样品在室温下放置24 h测试样品的制备后稳定性。通过对新制备的QC样品进行3次冻融循环,评价冻融循环过程的稳定性。


1.3.7 代谢组学数据处理

采用SIMCA 14.1分析血浆代谢物数据,在对总峰强度进行归一化处理之后,进行无监督的主成分分析(PCA)和有监督的正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA),获得导致两组之间显著差异的相关代谢物信息,结果的准确性用R2与Q2等参数评价[24],筛选出的差异代谢物通过人类代谢组数据库(HMDB)进行鉴定,最后将鉴定的潜在生物标志物导入MetaboAnalyst数据库进行处理分析得到潜在代谢通路。


1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0数据处理软件进行统计学分析,实验数据以平均数±标准差(±s)表示。多使用单因素方差分析(ANOVA)进行统计分析,比较不同组间双侧差异显著性,当P<0.05或P<0.01时,差异有统计学意义。


2 结果

2.1 动物一般情况及病理变化

正常组大鼠活动正常,排尿正常,体重增长平稳。模型组大鼠精神萎靡,尿量减少,皮毛易脱落,体重增长缓慢或下降。GUSM组和阳性组大鼠症状较模型组轻,尿量明显增加,体重无明显下降。正常大鼠肝色泽红润,质地柔软。模型组大鼠肝颜色深,质地变硬,表面可见明显的胶原增生。GUSM组和阳性对照组的肝体积、质地和颜色均有改善。


与模型组比较,GUSM组血浆ALT、AST水平显著降低(P<0.01),表明在大鼠肝纤维化模型中GUSM具有保护作用。HE染色结果如图2所示。正常组肝组织结构完整,无变性、坏死细胞,肝小叶结构清晰。模型组肝小叶结构破坏,纤维组织增生,假小叶形成,同时形成大量脂肪变性和坏死纤维间隔,间质内有弥漫性炎性细胞浸润。GUSM组和阳性组中,由于纤维组织的分裂,肝小叶结构紊乱,原肝小叶分叶不全,无假小叶形成,肝细胞形态与正常大鼠相似。


2.2 代谢组学方法验证

以血清(5个阳离子和5个阴离子模式)所选离子的峰强度和保留时间的相对标准偏差(RSDs)和相对误差(REs)来评价方法性能(表2)。结果表明,该实验方法是合理可靠的。


表2 血清样品的分析性能结果


2.3 肝代谢物谱分析及潜在生物标志物的鉴定

PCA分析得分图如图3,GUSM组与模型组比较,差异有统计学意义,GUSM组与正常组比较接近,说明GUSM组的代谢情况向正常组转变,GUSM对HF大鼠肝代谢紊乱具有调节作用。同时质控点相对集中,说明仪器稳定性好。


通过OPLS-DA分析,正常组和模型组在正、负离子模式下代谢轮廓明显分离,如图4,说明HF模型建立成功。使用分载荷图(scores plot,S-plot)并结和变量重要性投影(variable importance in the projection,VIP)值(VIP>1),共识别和筛选出16个变量(血清样本正离子模式7个,负离子模式9个)。通过与在线数据库HMDB和METLIN获得的代谢物进行准确的质量和MS/MS片段信息匹配,其质荷比见表3,所有来自样品的代谢物在各组中均有明显变化,表明GUSM对HF的治疗机制。


2.4 代谢组学的多变量统计分析

评估模型质量的参数结果汇总如表4所示,R2和Q2值大于0.9,表明该模型具有极好的解释和预测能力,而R2和Q2值大于0.5,表明该模型具有良好的解释和预测能力。以下结果表明该模型稳定可靠,可用于差异代谢物的筛选。


表4 评估模型质量的参数汇总


2.5 代谢途径分析

通过将筛选出的潜在生物标志物输入MetaboAnalyst进行分析,结果如图5。结果显示,这些生物标志物参与了5条代谢通路。其中,亚油酸和花生四烯酸代谢、鞘脂代谢和初级胆汁酸生物合成的影响值相对较高。


图5 肝纤维化大鼠血浆代谢通路分析


3 讨论

肝星状细胞的活化和增殖在肝纤维化的发生发展中起重要作用[25]。花生四烯酸的前体物质是亚油酸,花生四烯酸由肝中的亚油酸生成[26]。因此,HF大鼠血清中花生四烯酸的减少可能与肝中亚油酸生成反应的减少有关。有研究表明,高浓度的亚油酸和花生四烯酸对肝星状细胞有毒性作用,这与我们的研究结果一致,即模型组亚油酸和花生四烯酸的含量较低,而治疗组则较高,对肝星状细胞有毒性作用。


牛磺胆酸、牛磺熊脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸、12-酮基脱氧胆酸、甘氨胆酸和甘氨鹅脱氧胆酸作为胆汁的重要成分,与胆汁酸的初级生物合成有关[27]。胆固醇可转化为胆汁酸,是肝胆固醇代谢的主要途径,如果发生胆汁淤积,高浓度的胆汁酸会破坏细胞膜的脂质成分,产生氧化应激,最终导致肝纤维化[28]。甘氨胆酸是评价肝细胞功能和肝胆系统循环功能的敏感指标之一。当肝排泄胆酸受损时,肝细胞吸收甘氨胆酸的能力下降,血液循环中甘氨胆酸的含量增加。较高水平的牛磺胆酸、牛磺熊脱氧胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸通过转化为石胆酸而成为肝毒性物质。鹅脱氧胆硫酸盐和酮脱氧胆酸在HF大鼠血液中的浓度鲜有报道,有望成为新的HF标志物。


在体内大量动物模型中,1-磷酸鞘氨醇(S1P)通过细胞表面的S1P受体调控肝纤维化的发生发展[29]。然而实验结果与以往的研究不同,模型组的浓度明显降低。这一结果可能与S1P的屏障功能有关,即高浓度的S1P可以保护受损的肝细胞。S1P增强屏障功能的机制主要是通过调节细胞骨架蛋白的功能,加强细胞间连接,减少细胞间隙,降低血管通透性。S1P既有促进肝纤维化的作用,又有抑制肝纤维化的作用。因此,通过这一途径治疗肝纤维化需要进一步的探索和研究。


本研究结果表明,GUSM处理改变了亚油酸和花生四烯酸代谢、鞘脂代谢、初级胆汁酸生物合成等主要代谢通路。GUSM治疗组显著逆转了HF大鼠的代谢异常,支持GUSM对CCl4诱导的HF的治疗作用。所获得的代谢物谱可作为筛选HF大鼠模型药物疗效的早期生物标志物和动态指标。


本研究可以改进的部分:本文是参考了近几年未加内标的代谢组学实验研究[30,31]而选择了不加内标的非靶向代谢组学研究,而且本文的方法学考察也已证实了本实验结果的准确性,今后的科研中我们会考虑用加入内标的方式来完善实验过程、进而增加结果的可靠性。


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