苏木及其活性成分对耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌的体外抑制作用研究

摘    要：目的 探讨苏木及其活性成分对耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌（CRABA）的杀菌作用及巴西苏木素与美罗培南联合抑菌作用。方法 收集2020年该院检验科微生物室分离的10株CRABA，采用微量肉汤稀释法测定苏木萃取液和巴西苏木素的最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC），采用高效液相色谱技术测定苏木萃取液的主要抑菌组分，采用绘制生长曲线方法观察巴西苏木素对CRABA生长的抑制作用，采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定巴西苏木素对CRABA分泌蛋白的影响，棋盘法观察巴西苏木素与美罗培南联合应用的抑菌效果。结果 苏木萃取液对10株CRABA的MIC、MBC值均为15.62 mg/mL，巴西苏木素的MIC、MBC值均为0.50 mg/mL；高效液相色谱法和MIC测定得到巴西苏木素为苏木萃取液中主要抑菌组分。巴西苏木素与美罗培南联用时，巴西苏木素的MIC值由0.500 mg/mL降至0.125 mg/mL，美罗培南的MIC值由0.128 mg/mL降至0.064 mg/mL，FIC指数为0.75。结论 苏木中有效抑菌组分为巴西苏木素，其机制可能是通过影响细菌蛋白的分泌从而发挥杀菌作用。

关键词:苏木;巴西苏木素;原苏木素B;耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌;美罗培南;

In vitro inhibition of Sappan and its active components on Carbapenem-resistant

Acinetobacter Baumannii

XU Lingqing DU Liangqin YUAN Runqi YAN Jia CHEN Xuan JIAN Yonghuan ZHOU

Piaoyan

WEN Weihong LI Linhai

Department of Laboratory, the Sixth filiated Hospital of Guangzhou Medical University/Qingyuan

People's Hospital

Abstract：

Objective To explore the bactericidal effect of hematoxylin and its active ingredients on carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii and the combined antibacterial effect of Brazilian hematoxylin and meropenem. Methods 10 strains of carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii were collected, and MIC and MBC of hematoxylin extract and Brazilian hematoxylin were determined by the micro broth dilution method; HPLC was used to determine the main antibacterial components of hematoxylin extract; growth curve was used to observe the inhibitory effect of Brazilian hematoxylin on the growth of carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii; SDS-PAGE protein electrophoresis technique was used to determine the effect of Brazilian hematoxylin on the secreted protein of carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii; the checkerboard method was used to observe the antibacterial effect of the combined application of Brazilian hematoxylin and meropenem. Results The MIC value and MBC value of the extract of hematoxylin to 10 carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii were 15.62mg/mL; the MIC value of Brazilian hematoxylin to 10 carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii . Both the MBC value and the MBC value are 0.5mg/mL; Brazilian hematoxylin is obtained as the main antibacterial component in hematoxylin extract by high performance liquid chromatography; Prohematoxylin B has no inhibitory effect. When Brazilian hematoxylin is combined with meropenem, the MIC value of Brazilian hematoxylin is changed from 0.5mg/mL to 0.125mg/mL, and the MIC value of meropenem is changed from 0.128mg/mL It becomes 0.064mg/mL. Conclusion The effective antibacterial component in sappan is Brazilian hematoxylin, which may exert a bactericidal effect by affecting the secretion of bacterial proteins.

Keyword：

Sappan; Brazilian hematoxylin; protohematoxylin B; carbapenem-resistant acinetobacter baumannii; Meropenem;

鲍曼不动杆菌是一种需氧非发酵的革兰氏阴性杆菌，广泛存在于自然界及人体皮肤，为临床常见的条件致病菌[1]。由于其生存能力强，并且存在多种耐药机制，常常有多重耐药的特性，而这种多重耐药鲍曼不动杆菌已成为医院感染的重要病原菌[2,3]。碳青霉烯类抗菌药物曾被认为是抗菌活性最强内酰胺类抗菌药物,但随着此类药物的广泛使用，使得鲍曼不动杆菌的耐药性日益增强，故临床对此类细菌面临无药可用的窘境。苏木作为传统天然中药，具有广泛的生物活性。有研究表明，苏木中成分巴西苏木素对各类微生物都有抑制作用[4,5,6]，但对耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌(carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii,CRABA）的抑菌作用国内外鲜有报道，本研究通过体外实验探究巴西苏木素对CRABA的抑制作用及其机制，并将巴西苏木素与美罗培南进行联合药敏试验观察其抑菌作用，为中药治疗CRABA感染提供参考，现报道如下。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株来源

收集2020年本院检验科微生物室分离的10株CRABA，其中5株来源于重症监护室，2株来源于急诊科，3株来源于其他科室。鲍曼不动杆菌对任何一种碳青霉烯类药物耐药判定为CRABA株。质控菌株为：美国模式培养物集存库(American type culture collection，ATCC)25922大肠埃希杆菌（Escherichia coli，ECO）；ATCC 25923金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SAU）。

1.1.2试剂与仪器

苏木（康美药业股份有限公司）；苏木单体：巴西苏木素，原苏木素B（成都曼斯特生物科技有限公司）；美罗培南（北京索莱宝科技有限公司），血平板（江门市凯林贸易有限公司）；肉汤培养基与MH琼脂平板（广州市迪景生物科技有限公司）；二甲基亚枫（dimethyl sulfoxide，DMSO）（天津市富宇精细化工有限公司）；DHP-9145A电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司）；VITEK2 Compact全自动微生物分析仪（法国生物梅里埃公司）；uLtiMate 3000型高效液相色谱仪（美国赛默飞世尔科技有限公司）；酶标仪(德国BMG SPECTRO STAR NANO全波长)。

1.2方法

1.2.1 药物敏感试验

细菌分离培养鉴定及药物敏感性试验所有标本均按《全国临床检验操作规程(第4版)》及本实验室的作业指导书要求进行接种和培养，菌株分离纯化后使用VITEK-2 Compact全自动微生物分析系统进行菌种鉴定和常规药物敏感性试验，按2020年美国临床实验室标准化协会(clinical and laboratory standards institute，CLSI)标准[7]进行敏感性判断。

1.2.2苏木抑菌实验

1.2.2.1苏木萃取液、巴西苏木素和原苏木素B溶液制备

称量苏木100 g放于离心管中与无水乙醇200 mL以1:2的比例混匀，于恒温培养振荡器中震荡48 h然后离心，4 500 r/min离心5 min，取离心管称量并标记序号，取上清液于离心管中，开盖放入恒温培养振荡器中50 ℃震荡24~96 h以挥发尽无水乙醇，称取萃取后苏木质量，加适量DMSO配成1 000 mg/mL的萃取液原液，再取原液倍比稀释成成500.00、250.00、125.00、62.50、31.25、15.63、7.81、3.90 mg/mL共8个质量浓度。将巴西苏木素单体和原苏木素B单体分别用DMSO分别配制成64.000 0、32.000 0、16.000 0、8.000 0、4.000 0、2.000 0、1.000 0、0.500 0、0.250 0、0.012 5、0.063 0 mg/mL 共11个质量浓度。

1.2.2.2菌液制备

将所有CRABA接种于血平板，37 ℃培养18 h，挑取数个分离纯化后的菌落置于生理盐水试管中,比浊仪校正浓度至0.5麦氏单位(1.5×108 cfu/mL)。

1.2.2.3苏木萃取液对10株CRABA的MIC、MBC测定

于无菌96孔板中每孔加入肉汤菌液100 μL，第1个孔加入1 000 mg/mL苏木萃取液100 μL，采用微量倍比稀释法，使苏木萃取液质量终浓度分别为500.00、250.00、125.00、62.50、31.25、15.63、7.81和3.90 mg/mL共10个浓度，每孔加入菌液20 μL。将96孔板放37 ℃培养箱培养18 h。

1.2.2.4巴西苏木素对10株CRABA的MIC、MBC测定

于无菌96孔板中每孔加入肉汤100 μL，而后加入10个浓度分别为64.000 0、32.000 0、16.000 0、8.000 0、4.000 0、2.000 0、1.000 0、0.500 0、0.250 0、0.012 5、0.063 0 mg/mL的巴西苏木素溶液100 μL，每孔加入菌液20 μL，取菌液200 μL作为阳性对照，肉汤培养基200 μL作为阴性对照。将96孔板放37 ℃培养箱培养18 h。

1.2.2.5原苏木素B对10株CRABA的MIC测定

于无菌96孔板中每孔加入肉汤100 μL，而后加入10个浓度分别为64.000 0、32.000 0、16.000 0、8.000 0、4.000 0、2.000 0、1.000 0、0.500 0、0.250 0、0.012 5、0.063 0 mg/mL的原苏木素B溶液100 μL，每孔加入菌液20 μL，取菌液200 μL作为阳性对照，肉汤培养基200 μL作为阴性对照。将96孔板放37 ℃培养箱培养18 h。

1.2.3高效液相检测苏木组分

1.2.3.1样品提取

称取苏木各5 g置于锥形瓶中，加入乙醇100 mL，用封口膜把瓶口封好。超声提取30 min，用0.22 μm有机膜滤膜过滤到样品瓶中。

1.2.3.2标准品溶液的制备

分别精密称取苏木提取液，巴西苏木素，DMSO，置于3个灭菌EP管中

1.2.3.3 高效液相色谱法检测

采用C18（5 μm，4.6 mm×250.0 mm）色谱柱，流速为1.0 mL/min，检测波长210 nm，柱温35 ℃，进样量5 μL。流动相为乙腈：水，梯度洗脱条件见表1。

1.2.4 CRABA的生长曲线测定

取培养至对数生长期的CRABA，用无菌生理盐水配制成0.5麦氏浊度，取100 μL菌液分别加入到巴西苏木素浓度不同的100 μL肉汤培养基中，使肉汤中巴西苏木素的浓度为1/8 MIC（0.063 mg/mL）、1/2 MIC（0.250 mg/mL）、1 MIC（0.500 mg/mL）。每隔4 h进行取样，用酶标仪检测600nm处的吸光度值，绘制生长曲线。

1.2.5十二烷基磺酸钠(sodium 1-dodecanesulfonate,SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)

取培养至对数生长期的CRABA，配制成0.5麦氏浊度，取3 mL菌液分别加入到巴西苏木素浓度不同的3 mL肉汤培养基中，使巴西苏木素的浓度为1/8 MIC（0.063 mg/mL）、1/2 MIC（0.250 mg/mL）、1 MIC（0.500 mg/mL）。置于37 ℃、200 r/min摇床培养，于16 h取样4 mL，3 155×g离心10 min，除去上清液，收集菌体；加入4 mL磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution，PBS）缓冲溶液并萃取，洗涤1次（3 155×g离心10 min），再加入2 mL PBS，取等体积（1 mL）的各标本加入EP管，5 560×g离心5 min(23 ℃)收集菌体，重悬于160 μL PBS并加40 μL蛋白上样缓冲液混匀，沸水浴10 min转速300 r/min后13 350×g离心10 min，取上清备用。选用12%分离胶，5%浓缩胶，上样20 μL进行SDS-PAGE。经考马斯亮蓝染色1 h后脱色，显示蛋白谱带。

1.2.6巴西苏木素与美罗培南联合抑菌实验

配制不同浓度的巴西苏木素+美罗培南肉汤各200 μL加入96孔板，加入配制试验菌液20 μL，37 ℃培养24 h，观察结果。记录MIC甲药单用和MIC乙药单用，并观察两药联用的MIC甲药联用和MIC乙药联用，相加值最小数值为最佳组合，计算部分抑菌浓度（FIC）指数。FIC指数≤0.5为协同作用，＞0.5~1.0为相加作用，＞1.0~2.0为无关作用，＞2.0为拮抗作用。

2 结果

2.1 菌株药敏检测结果

药敏检测结果显示，10株CRABA对哌拉西林、头孢他啶、头孢噻肟、头孢吡肟、氨苄西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、亚胺培南、庆大霉素、阿米卡星、环丙沙星、左氧氟沙星、四环素耐药率为100%，对粘菌素耐药率为0%。

2.2 MIC、MBC测定结果

苏木萃取液对10株CRABA的MIC：10株菌株均为15.62 mg/mL；MBC：10株菌株均为15.62 mg/mL。巴西苏木素对10株CRABA的MIC：10株菌株均为0.50 mg/mL；MBC：10株菌株均为0.50 mg/mL。原苏木素B对10株CRABA的MIC：10株菌株均无效。

2.3 苏木组分高效液相图谱

DMSO的高效液相图谱见图1，苏木萃取液的高效液相图谱见图2，巴西苏木素的高效液相图谱见图3，说明苏木萃取液中产生抑菌作用的组分为巴西苏木素。

2.4 巴西苏木素对CRABA生长的影响

巴西苏木素药物浓度越大，其对CRABA的抑制生长作用越强，见图4。

2.5 SDS-PAGE图谱

随着巴西苏木素浓度的增大，其对CRABA的分泌蛋白抑制作用越强，见图5。

2.5 SDS-PAGE图谱

随着巴西苏木素浓度的增大，其对CRABA的分泌蛋白抑制作用越强，见图5。

3讨论

近年来随着碳青霉烯类药物的广泛使用，耐碳青霉烯类革兰阴性菌感染日益突出，其中CRABA所致感染的发病率和病死率均较高，治疗难度较大。CRABA仅对多粘菌素B的敏感性最高，耐药率为1.4%，但因其肾毒和神经毒性作用，临床甚少使用；对头孢哌酮－舒巴坦、米诺环素、左氧氟沙星和阿米卡星的耐药率分别为33.0%、42.2%、45.5%和40.2%，对头孢他啶、亚胺培南、美罗培南和环丙沙星等耐药率均在50%以上[8,9]。目前针对CRABA的治疗手段非常有限，主要是头孢哌酮舒巴坦、喹诺酮类和氨基糖苷类的药物。因此，针对CRABA探索新型药物已成为研究的热点。

苏木的主要活性成分为多种生物碱，研究表明其中的巴西苏木素在抗菌中起主要作用。蒲荣[5]等发现巴西苏木素对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为14.85 mm，MIC为12.5 μg·mL；KIM等[10]发现苏木中的巴西苏木素对MRSA、耐万古霉素肠球菌及其他菌种具有很强的抑制作用，MIC为4~32 μg /mL。因此本实验将探讨苏木活性成份对CRABA的体外抑菌作用，为中药抑菌研究提供理论支持。

既往研究发现，大部分抑菌的中药对细菌的生长和蛋白谱的表达均有影响[11]。本实验研究也获得了相似的结果，在不同浓度巴西苏木素作用下，CRABA的生长受到明显抑制，细菌可溶性蛋白表达发生了明显变化，说明巴西苏木素对CRABA的抑菌作用可能与其影响细菌生长、蛋白质的表达有关，其机制还需要进一步研究。

目前中药很少被系统地应用于临床，其主要原因在于中药对细菌抑菌作用低于常用抗生素，然而有研究表明，某些中药与抗菌药物联用可以产生显著的增效作用，因此中药与抗菌药物联用成为新的研究思路。本实验创新性的将巴西苏木素和美罗培南进行联合用药试验以观测对CRABA的抑制作用，发现二者联合用药与单药比较，抑菌效果得到了显著增强，本研究虽然证实美罗培南与巴西苏木素对CRABA有相加效应，但从体外抑菌试验结果分析，美罗培南与巴西苏木素联合用药要达到完全抑菌效果，巴西苏木素药物浓度较低时，美罗培南仍需较高浓度，如何使二者联用发挥更好的抑菌作用，尚需进一步研究。

综上所述，中药抗菌具有较好的前景，它作用于抗菌的各个环节，一方面可以直接作用于微生物本身，如破坏细菌细胞壁和细胞膜的完整性改变细胞通透性、抑制细菌生物被摸的形成等机制[12,13]；另一方面通过逆转细菌耐药性，促进他药物的杀菌作用，如抑制耐药菌外排泵、消除耐药质粒R等机制[14,15]。本研究初步探讨了巴西苏木素对CRABA蛋白质合成的影响，不足之处在于（1）所采用菌株数量较少，且它们的药敏检测结果相同，故10株菌所得到的结果也完全相同，虽然表明本研究的重复性较好，但所得结果不能证明巴西苏木素对耐药性不同的CRABA都有很好地抗菌作用，其结果存在一定的偏移性，为临床提供的帮助存在局限性。（2）未对其他抑菌机制展开研究，且仅处于体外实验阶段，不能有效的评价巴西苏木素在体内的疗效。因此，未来将展开进一步的实验以探讨巴西苏木素抑菌作用的机制，为今后体外实验、临床试验及应用提供理论依据，使巴西苏木素的抑菌活性真正发挥其功效。

参考文献

[1] KIM B,KIM K,YOON J S.Nosocomial acinetobacter baumannii infection in children in adult versus pediatric intensive care units[J].Pediatr Int,2020,62(4):451-458.

[2] MAO T,ZHAI H,DUAN G,et al.Patterns of drug-resistant bacteria in a general hospital,China,2011—2016[J].Pol J Microbiol,2019,68(2):225-232.

[3] KARYNE R,CURTY LECHUGA G,ALMEIDA SOUZA A L,et al.Pan-drug resistant acinetobacter baumannii,but not other strains,are resistant to the bee venom peptide mellitin[J].Antibiotics (Basel),2020,9(4):178.

[4] PUTTIPAN R,CHANSAKAOW S,KHONGKHUNTHIAN S,et al.Caesalpinia sappan:a promising natural source of antimicrobial agent for inhibition of cariogenic bacteria[J].Drug Discov Ther,2018,12(4):197-205.

[5] LANE C R,SUTTON B,VALCANIS M,et al.travel destinations and sexual behavior as indicators of antibiotic resistant shigella strains--Victoria,Australia[J].Clin Infect Dis,2016,62(6):722-729.

[6] NIRMAL N P,RAJPUT M S,PRASAD R G,et al.Brazilin from Caesalpinia sappan heartwood and its pharmacological activities:a review[J].Asian Pac J Trop Med,2015,8(6):421-430.

[7] M100-S20.Performance standards for antimicrobial susceptibility testing.Twentieth informational supplement[S].

[8] HUANG H,CHEN B,LIU G,et al.A multi-center study on the risk factors of infection caused by multi-drug resistant Acinetobacter baumannii[J].BMC Infect Dis,2018,18(1):11.

[9] BUTLER D A,BIAGI M,TAN X,et al.Multidrug resistant acinetobacter baumannii:resistance by any other name would still be hard to treat[J].Curr Infect Dis Rep,2019,21(12):46.

[10] SYAMSUNARNO M R A,SAFITRI R,KAMISAH Y.Protective Effects of Caesalpinia sappan Linn.and Its Bioactive Compounds on Cardiovascular Organs[J].Front Pharmacol,2021,12:725745.

[11] HWANG H S,SHIM J H.Brazilin and Caesalpinia sappan L.extract protect epidermal keratinocytes from oxidative stress by inducing the expression of GPX7[J].Chin J Nat Med,2018,16(3):203-209.

[12] KONG X,WAN H,SU X,et al.Rheum palmatum L.and Coptis chinensis Franch.,exert antipyretic effect on yeast-induced pyrexia rats involving regulation of TRPV1 and TRPM8 expression[J].J Ethnopharmacol.2014 Apr 11;153(1):160-168.

[13] HUANG X,WANG P,LI T,et al.Self-assemblies based on traditional medicine berberine and cinnamic acid for adhesion-induced inhibition multidrug-resistant staphylococcus aureus[J].ACS Appl Mater Interfaces,2020,12(1):227-237.

[14] LI T,WANG P,GUO W,et al.Natural berberine-based chinese herb medicine assembled nanostructures with modified antibacterial application[J].ACS Nano,2019,13(6):6770-6781.

[15] SINGH S,PATHAK N,FATIMA E,et al.Plant isoquinoline alkaloids:advances in the chemistry and biology of berberine[J].Eur J Med Chem,2021,226:113839.